1.1. Построение простой калибровочной кривой и ее проверка

Для построения простой калибровочной кривой приготовляют 5 разных разведений из концентрированного (основного) стандартного раствора. Абсорбцию каждой пробы, включая «холостую», определяют 3 раза. При этом в качестве раствора сравнения используют воду или соответствующий растворитель. Для каждого из 6 троекратных определений (5 исследований раствора стандарта и одно — «холостой пробы») вычисляют средние величины. Усредненный показатель «холостой пробы» вычитают из аналогичных величин стандартных проб.

Скорректированные таким образом средние значения абсорбции располагают на оси ординат калибровочного графика (величина экстинкции «холостой пробы» совпадает с нулевой точкой координат). Из соответствующих точек оси ординат проводят тонкие линии, параллельные оси абсцисс.

На оси абсцисс наносят значения концентрации. Из полученных точек восстанавливают перпендикуляры и через места их пересечений с перпендикулярами, восстановленными из соответствующих точек оси ординат, проводят калибровочную кривую.

Для проверки простой калибровочной кривой третья (средняя) концентрация определяется 20 раз, и из 20 полученных величин вычисляют Х (среднюю арифметическую) и S (среднеквадратическое, или стандартное, отклонение). После этого через нулевую точку и точку средней величины 20-кратного определения проводят прямую линию. Основные калибровочные точки должны быть расположены от этой прямой не дальше чем на +1,2 S. Если это условие выполнено, то калибровочная кривая может считаться прямолинейной и достаточно точной.

1.2. Пример построения калибровочной кривой

Пусть требуется построить калибровочную кривую для определения в сыворотке (плазме) крови концентрации вещества А. Если оно у практически здоровых людей составляет 60—80 г/л, то для построения калибровочной кривой используют растворы стандарта с концентрацией, охватывающей физиологические величины и выходящей за их пределы. Выбирают, например, интервал значений 20—120 г/л. Поскольку стандартное вещество — как правило, дефицитный реактив, а со временем техника выполнения анализа совершенствуется, то для сохранения стандарта и соблюдения одинаковых условий определения на протяжении всего периода исследований строить калибровочную кривую можно лишь после того, как возникает уверенность в том, что техника аналитических определений достаточно хорошо отлажена и в дальнейшем не будет изменяться. Об этом свидетельствует хорошая воспроизводимость результатов в серии и изо дня в день.

Сначала готовят основной раствор. Чем он концентрированнее, тем дольше сохраняется в нем стандартное вещество. Даже если концентрация основного стандартного раствора является неточной (процентной), готовить его следует, пользуясь весами для очень точного взвешивания и точной мерной посудой. Иногда приготовляют промежуточные разбавления (перед получением ряда рабочих растворов стандарта), но чаще всего из основного раствора сразу получают конечные разбавления. Из каждого разведения основного раствора стандарта с концентрацией 20, 40, 60, 80, 100 и 120 г/л отбирают, к примеру, по 0,1 мл раствора (ровно столько, сколько берется сыворотки или другого биологического материала для исследования) и вносят в первые три пробирки каждого из трех рядов их, размещенных в большом четырехрядном штативе. В последующем в пробирки добавляют «цветной» реагент известного объема. Определяют экстинкцию каждого из растворов, содержащих одинаковое количество стандартного вещества, и полученные значения абсорбции усредняют (если одно из трех «выскакивает», то его не учитывают: оно знаменует собой техническую ошибку взвешивания). Допустимо наносить (в виде крестика) каждое из трех определений в выбранной системе координат и в дальнейшем из них брать среднее по расположению в системе координат.

На миллиметровой (калибровочной) бумаге вычерчивают оси координат. На оси ординат откладывают значения абсорбции, на оси абсцисс — концентрации. Чтобы считываемые с калибровочной кривой значения были более точными, следует брать масштаб графика достаточно крупным.

Опыт работы показывает, что масштаб калибровочного графика должен быть 20 см и более на общих осях. Чтобы кривая располагалась под углом ~ 45° к осям, берут максимальные значения концентрации и абсорбции, если между ними в пределах этих значений сохраняется прямо пропорциональная зависимость. В приведенном нами конкретном примере отрезок из 20 крупных (односантиметровых, десятимиллиметровых) клеток на оси абсцисс составляет 120 г/л, а на оси ординат максимальное из полученных для 6 определений значение абсорбции равно 0,6. На основании этих данных находят факторы калибровки по формулам (1) и (2).

(1)

(2)

где 6 г/л и 0,03 — значения концентрации и абсорбции, соответствующие масштабу 1 см (одна крупная клетка). Разделив 6 г/л и 0,03 на 10, находят цену 1 мм деления на осях абсцисс и ординат.

Через точки, обозначенные крестиками, проводят линию, пользуясь прозрачной линейкой, так, чтобы она проходила через большинство точек. Точки, не попавшие на линию, должны располагаться поблизости от нее, будучи равномерно удалены в ту и другую стороны.

Чтобы облегчить процедуру откладывания на оси ординат значений абсорбции стандартных и опытных проб, рекомендуется разделить величину экстинкции (например 0,2) на 0,03 (0,2/0,03). Полученное число (в данном случае 6,67) показывает, на каком удалении от нулевой точки в сантиметрах следует сделать отметку для восстановления из нее перпендикуляра: отмеряют отрезок в 6 крупных (1 см) клеток и 7 мм. Так же поступают со всеми остальными значениями, чтобы их разместить на вертикальной и горизонтальной осях. Из отложенных на осях значений восстанавливают перпендикуляры, места пересечения тонких линий обозначают крестиками; ориентируясь на них, проводят калибровочную кривую.

Помимо нахождения факторов, отражающих цену деления большой и малой клетки на горизонтальной и вертикальной осях, рассчитывают фактор пересчета по формуле: ƒ = С/А. При этом лучше всего найти соответствующий фактор для каждой из шести точек измерений и затем установить среднее значение этих показателей:

С помощью микрокалькулятора можно быстро определить концентрацию вещества в опытной пробе по формуле: С = ƒА, даже если число ƒ не круглое.

Ц ену деления на оси ординат можно найти и другим способом. Пусть А1 = 0,28; С1 = 60 г/л; А2 = 0,40; С2 = 80 г/л. Составляем пропорцию: 0,28 — 60, 0,01 — X.

На осях координат отмеривают одинаковые отрезки для соответствующих показателей абсорбции и концентрации.