Методы выделения нуклеиновых кислот

■

Для проведения молекулярного анализа нуклеиновых кислот, прежде всего необходимо получить их в чистом виде. Если источником нуклеиновых кислот служат клинические образцы, биоптаты, следы, оставленные на месте преступления, то необходимо подобрать оптимальные методы выделения, позволяющие получить максимальное количество высокоочищенного продукта, поскольку размер таких образцов обычно очень мал и часто их очень сложно получить повторно. При работе с культурами клеток можно использовать более простые методы выделения, так как выход нуклеиновых кислот увеличивается пропорционально объему культуры.

ДНК может быть выделена из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра. В типичной диплоидной клетке человека в норме содержится примерно 7 пг геномной ДНК и разное количество митохондриальной ДНК; в результате суммарный продукт будет представлять собой смесь геномной и митохондриальной ДНК. В большинстве случаев митохондриальная ДНК не мешает проведению анализов и эксперименты можно проводить с суммарными препаратами ДНК. В тех случаях, если необходима чистая геномная ДНК, то необходимо изолировать ядра и выделить из них ДНК.

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК.

Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис клеток, удаление центрифугированием клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение белков и их удаление из раствора с помощью фенола и хлороформа, концентрирование молекул ДНК осаждением в этаноле.

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ОБРАЗЦОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови, для, чего собирают в стерильные пробирки 5-10 мл венозной крови с раствором, препятствующим коагуляции (например глюгициром или цитратом натрия) в соотношении 4:1. Замороженные образцы крови могут храниться при -20 С^с в течение нескольких месяцев.

Материалы:

• Лизирующий раствор: 0.32 М сахароза, 0.01М трис-HCl, рН7.6, 5 мМ MgCl₂, 1 % тритона Х-100

8

• Протеиназа К. Растворяют лиофилизированную протеиназу К в стерильной дистиллированной воде в концентрации 10 мг/мл, разливают на аликвоты и хранят при -20 °С.

• 10 % раствор додецилсульфата натрия; к 100 г SDS-Na добавить 900 мл дистиллированной воды, на водяной бане при перемешивании нагреть до 68°С до полного растворения , довести после охлаждения до рН 7.6 и объем до1 литра.

• Насыщенный буфером фенол. В большинстве случаев фенол высокой степени чистоты можно использовать без дополнительной перегонки. Расплавляют фенол при 65 °С в присутствии равного объема 0.5 М трис-HCl, рН 7.8-8.0, содержащего 0.2% 8-гидроксихинолин и 0.2% 2- меркаптоэтанола (2-МЭ) (ядовит, летуч!, работать под тягой!). Когда фенол полностью расплавится, тщательно перемешивают смесь, отбирают насыщенный фенол. В таком виде фенол может хранится при 4 °С до 1 мес, замороженный при -20 °С - в течение нескольких месяцев.

• Смесь хлороформ : изоамиловый спирт (24:1, о/о).

• Охлажденный до - 20 °С 96% этанол.

Этапы выделения

1. К 8 мл жидкой крови добавить 2 мл глюгицира, тщательно перемешать. В таком виде кровь может храниться при - 20 °С течение нескольких месяцев. Для выделения ДНК кровь разморозить, перенести в стеклянный центрифужный стакан, добавить 50 мл лизирующего раствора, тщательно перемешать. Центрифугировать при 4 °С в течение 15-20 мин при 7000 об/мин.

2. Осторожно слить надосадочную жидкость, растереть осадок стеклянной палочкой и добавить 8 мл 25 мМ ЭДТА, 75 мМ NaCl, рН 8.0, тщательно перемешать, добавить 800 мкл 10% SDS-Na, перемешать, инкубировать 1-2 мин, затем добавить 50 мкл протеиназы К. Перемешать очень мягким покачиванием и поместить в термостат с температурой 37-42 °С, на 14-18часов, можно на ночь.

3. На следующий день вынуть стаканы из термостата, добавить к лизату 8 мл фенола, рН 7.8, перемешать в течение 5 мин, центрифугировать при 4000 об/мин, в течение 10 мин при 4°С.

4. После центрифугирования жидкость расслаивается на три фракции: верхняя, водная фаза содержит ДНК, в средней фазе находятся белки и в нижней фазе фенол. Осторожно отобрать верхнюю водную фазу с помощью автоматической пипетки и перенести в чистые стаканы. Для удобства отбора можно отрезать кончик наконечника на 2-3 мм. На

9

этом этапе в случае незначительного количества исходного материала, можно для увеличения выхода ДНК захватить незначительное количество средней фракции.

5. Добавить к отобранной фракции 4 мл фенола и 4 мл хлороформа, тщательно перемешать круговыми движениями, центрифугировать при 4000 об/мин, в течение 10 мин при 4°С.

6. Отобрать водную фазу, содержащую ДНК, не захватывая при этом средний слой, перенести в чистые стаканы и добавить 8 мл хлороформа, перемешать, центрифугировать при 4000 об/мин, в течение 10 мин при 4°С.

7. Очень тщательно отобрать верхнюю водную фазу в чистые стеклянные колбы, добавить двухкратный объем охлажденного этанола и при мягком вращении колбы осадить ДНК. Осторожно слить спирт, промыть ДНК еще 1-2 раза этанолом , последний раз промыть 70 % этанолом.

8. Удалить этанол центрифугированием при 10000 об/мин, 5мин, подсушить осадок ДНК при комнатной температуре и растворить в стерильной деионизованной воде. Разлить ДНК по аликвотам и хранить при 4 °С.

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК В СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ.

Одно из наиболее значительных достижений современной науки, которое все шире применяют в судебной медицине - метод генотипирования (синонимы: ДНК-дактилоскопия, ДНК-

фингерпринтинг). Сущность этой технологии, которая основана на анализе генетических компонентов клеток, является использование ДНК-проб различных участков человеческого генома, проявляющих значительную вариабельность среди индивидов.

Индивидуальные генетические различия (полиморфизм) можно обнаружить, исследуя высокополиморфные участки молекул нуклеиновых кислот, например участки с варьирующим числом коротких тандемных повторов (variable number of tandem repeat, VNTR). Анализ аллельных вариантов нескольких полиморфных VNTR-локусов позволяет проследить родственные связи индивидуума или установить причастность того или иного лица к преступлению.

Для выделения ДНК из объектов биологического происхождения, обнаруженных на месте преступления применяются различные методы и выбор конкретного зависит от типа анализируемого образца. В то же время в основе любого метода лежит лизис клеток с высвобождением ядерной ДНК и очистка ДНК от белков, в частности ДНК-полимераз.

ю

Очень важно исключить попадание в препараты нуклеаз и ДНК от экспериментатора, а также продуктов предшествующих ПЦР-амплификаций или других препаратов ДНК; их источниками могут быть загрязненные реактивы и оборудование (особенно автоматические микропипетки). В связи с этим всю работу по выделению ДНК необходимо проводить в перчатках и - там, где это возможно, -использовать автоклавированные растворы и лабораторную посуду.

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ КРОВЯНОГО СГУСТКА.

1. Нарезать примерно 0.4 мл кровяного сгустка на маленькие кусочки в стерильной чашки Петри и перенести в стерильную микроцентрифужную пробирку.

2. Промыть сгусток в 1 мл lxSSC (0.15 М NaCl, 0.015 М цитрат натрия, рН 7.0); удалить супернатант.

3. Ресуспендировать сгусток в 0.4 мл 0.2 М ацетата натрия и добавить 20 мкл протеиназы К с концентрацией 10 мг/мл, 20 мкл 1М ДТТ, 30 мкл 10% SDS.

4. Инкубировать от 6 до 24 часов при 56 °С.

5.Провести дважды фенольную экстракцию и один раз экстракцию смесью хлороформ:изоамиловый спирт (24:1).

6. Добавить 1 мкл гликогена с исходной концентрацией 20 мг/мл до проведения первой этанольной преципитации, затем провести процедуру осаждения, промыть, высушить осадок как приводится в описании для цельной крови. Если ДНК не наматывается и становится видимой при добавлении этанола, необходимо выдержать пробирку при -20°С в течение 1 часа до центрифугирования. Этот дополнительный этап требуется для большинства судебно-медицинских образцов.

Аналогичным образом проводится выделение ДНК из мышечной, эмбриональной ткани и ворсинок хориона.

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ПЯТЕН КРОВИ: ПРЯМОЙ ЛИЗИС.

1. Разрезать ткань с пятном крови (приблизительно 1 см²) на маленькие кусочки на стерильной поверхности и перенести в стерильные пробирки.

2. Лизировать в 0.5 мл буфера: 20 мМ трис-HCl, рН 8.0, 20 мМ ЭДТА, 0.2 М NaCl, 4% SDS; добавить 0.4 мл воды, 40 мкл 1 М ДТТ, 20 мкл 20 мг/мл протеиназы К. Инкубировать при 37 °С в течение ночи.

3. Отобрать как можно больше супернатанта, затем промыть материал еще 0.2 мл стерильной воды и добавить к первому супернатанту в микроцентрифужной пробирке.

4. Очистить и осадить ДНК как описано для кровяного сгустка.

п

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ПЯТЕН СПЕРМЫ, ВАГИНАЛЬНЫХ, ОРАЛЬНЫХ, АНАЛЬНЫХ МАЗКОВ: ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ

ЛИЗИС.

Для отделения сперматозоидов от вагинального эпителия может быть использована процедура "дифференциального лизиса", при которой материал предварительно инкубируется в лизирующем растворе без ДТТ. При этом ядра вагинального эпителия разрушаются, а ядра сперматозоидов остаются интактными, лизируются при последующем добавлении ДТТ.

1. Отрезать пятно или верхнюю часть тампона (мазка) и поместить в стерильную пробирку. Добавить 5.6 мл лизирующего раствора: 100 мМ NaCl, ЮмМ ЭДТА, 0.38 мл 10% SDS и 0.15 мл протеиназы К с концентрацией 10 мг/мл, инкубировать по крайней мере 2 часа при 56°С. Если имеется сильное загрязнение эпителиальными клетками, то это время должно быть увеличено.

2. Перенести супернатант от материала в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте в течение 4-х минут в микроцентрифуге при 14000 об/мин.

3. Промыть материал или мазок дважды аликвотой по 1.5 мл NaCl/ЭДТА и добавить к предыдущему супернатанту. Использовать супернатант для очистки ДНК, как это указано для выделения ДНК из кровяного сгустка.

4. Вторичный лизис: ресуспендировать осадок спермы в 0.4 мл 2М ацетата натрия. Добавить 20 мкл 1М ДТТ, 20 мкл протеиназы К (с концентрацией 10 мг/мл), 30 мкл 10% SDS и инкубировать при 37 °С в течение ночи.

6. Очистить и осадить ДНК как описано для кровяного сгустка.

При проведении "дифференциального лизиса" нужно иметь в виду, что не всегда удается полностью освободится от эпителиальных клеток полностью; в то же время, часть сперматозоидов (особенно в старых пятнах), может разрушиться уже во время предварительного лизиса. В связи с этим при малых количествах исследуемого материала нецелесообразно проводить предварительный лизис.

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ КОРНЕЙ ВОЛОС.

1. Отделить корни от основной части волоса и поместить в микроцентрифужную пробирку объемом 0,4 мл.

2. Добавить 100 мкл экстракционного буфера, так, чтобы было обеспечено погружение всех корневых корешков на дно пробирки.

3. Инкубировать при 37 °С в течение ночи.

12

4. Очистить и осадить ДНК как описано для кровяного сгустка.

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ КРОВИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ CHELEX

1. В центрифужную пробирку типа "Eppendorf' внести 1 мл дистиллированной воды, 5 мкл крови или 3 мм² материала с засохшей кровью, тщательно перемешать. Инкубировать 30 мин при комнатной температуре, перемешивания на вортексе или качающейся платформе.

2. Центрифугировать в течение 3 мин при 14000 об/мин и осторожно удалить супернатант, оставляя 20-30 мкл супернатанта на дне пробирки, чтобы не взмутить осадок клеток или ткань.

3. Добавить 5%-ную взвесь Chelex до конечного объема 200 мкл. Когда добавляется Chelex, взвесь должна быть однородной; для этого во время отбора необходимо перемешать Chelex до гомогенного состояния пипеткой с наконечником на 1 мл.

4. Инкубировать при 56 °С в течение 30 мин, встряхнуть на вортексе 10 сек.

5. Выдержать образец в кипящей водяной бане или термостате при 100 °С в течение 8 мин, перемешать на вортексе в течениеЮ сек.

6. Центрифугировать при 14000 об/мин в течение 3 мин, надосадочную жидкость в объеме 10-20 мкл использовать для постановки ПЦР. Остатки супернатанта можно хранить при температуре -20 °С до повторного использования.