Выделение рнк

Типичная клетка млекопитающих содержит около 15 пг РНК; из них 80-85% приходится на долю рибосомной (28S, 18S и 5S) РНК, а остальная часть представлена в основном низкомолекулярными РНК (транспортными и малыми ядерными). И лишь 1-5% суммарной РНК составляет информационная РНК (мРНК), гетерогенная как по размеру, так и по первичной структуре. В большинстве случаев на 3'-конце мРНК эукариот находится poly(A)- "хвост". Он может образовывать комплекс с фрагментом oligo(dT), что позволяет проводить очистку мРНК с помощью аффинной хроматографии на о^о(с1Т)-целлюлозе.

Основные этапы выделения ДНК и РНК в принципе не различаются, варьируют лишь некоторые методические приемы. РНК по сравнению с ДНК гораздо более лабильна и чувствительна к действию нуклеаз, а сами РНКазы значительно менее чувствительны к денатурации чем ДНКазы. Все это затрудняет получение полноразмерной РНК и заставляет

13

проводить инактивацию РНКаз одновременно с лизисом. При выделении РНК необходимо учитывать следующее:

• значительные количества РНКаз находятся на нашей коже, поэтому выделение РНК следует проводить в одноразовых резиновых перчатках;

• вся используемая вода должна быть обработана диэтилпирокарбонатом (ДЭПК) при 37°С в течение ночи и затем проавтоклавирована. После такой обработки вода становится полностью свободной от РНКаз и может быть использована для приготовления растворов и мытья посуды. Надо иметь в виду, что ДЭПК активно реагирует с содержащими аминогруппы веществами и поэтому не может применяться для обработки растворов, содержащих трис. Трис-содержащие буферы надо готовить на обработанной ДЭПК воде из специально предназначенных для молекулярной биологии препаратов триса и после приготовления автоклавировать. Необходимо всегда помнить данные о том, что ДЭПК является канцерогеном, поэтому при работе с ним необходимо соблюдать меры предосторожности;

• использовать только одноразовую пластиковую посуду. Обычную лабораторную стеклянную или пластиковую посуду необходимо замочить в обработанной ДЭПК воде на 2 ч при 37 °С, затем тщательно промыть в этой же воде и проавтоклавировать;

• необходимо иметь отдельное лабораторное оборудование (пипетки, камеры для электрофореза, стеклянную и пластиковую посуду и т.д.), предназначенное исключительно для работы с РНК, и выделить в лаборатории место, где не проводится никаких работ с РНКазами;

• ингибиторы РНКаз должны использоваться везде, где это возможно: в буферах для выделения и хранения РНК, анализе РНК и т.д.

ВЫДЕЛЕНИЕ РНК С ПОМОЩЬЮ ГУАНИДИНТИОЦИАНАТА

Гуанидинтиоцианат - очень сильный денатурирующий агент, который используется для одновременного лизиса клеток и денатурации всех клеточных белков (в том числе РНКаз). Плавучая плотность РНК (около 1,9 г/мл) намного выше, чем ДНК и белков, ее можно отделить от других клеточных компонентов равновесным центрифугированием в градиенте плотности CsCl.

Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК.

14

1. Исследуемый образец клеток [(1-5) «10⁷] отмывают ФСБ, добавляют 3 мл буфера для гомогенизации: 4М гуанидинтиоцианат, 100 мМ трис- НС1, рН7.5, 1% |3-меркаптоэтанола, интенсивно перемешивают;

2. Набирают гомогенат в стерильный шприц для подкожных инъекций с иглой N23 и выдавливают его обратно в пробирку; эту процедуру повторяют 5 раз;

3. Осаждают все негомогенизированные фрагменты ткани центрифугированием при 3500 g в течение 10 мин при комнатной температуре (данный этап можно не проводить, если РНК выделяют из клеточной суспензии);

4. Центрифугирование в градиенте плотности можно проводить следующими способами: а) если используется ротор Beckman SW41 (или его аналог), то в чистую центрифужную пробирку наливают 8 мл 5.7 М CsCl и сверху наслаивают гомогенат; б) если используется ротор SW55, то 0.8 г CsCl добавляют к каждому мл гомогената и наслаивают полученный раствор в центрифужной пробирке на 1.5 мл 5.7 М CsCl. В процессе центрифугирования ДНК будет собираться в верхней части подслаивающего раствора, а РНК образует осадок на дне пробирки. РНК при этом будет получена в интактном виде, а фрагменты ДНК будут иметь слишком маленький размер (примерно 30 т.н.), чтобы их можно было использовать в большинстве экспериментов.

5. Центрифугируют при 200000g в течение 16 ч при 20 "С (45000 об/мин, если используется ротор SW55) или при 135O00g в течение 24 ч при 20 °С (32000 об/мин, если используется ротор SW41).

6. Осторожно отсасывают супернатант до уровня подслаивающего раствора, после этого при необходимости можно отобрать клеточную ДНК, образующую в верхней части подслаивающего раствора видимую белую полосу;

7. Осторожно, чтобы не взмутить осадок РНК, микропипеткой полностью отбирают весь оставшийся раствор;

8. Добавляют в пробирку 750 мкл этанола и переносят его вместе с осадком РНК в микроцентрфужную пробирку; центрифужную пробирку промывают 750 мкл 80% этанола и переносят его в ту же микроцентрифужную пробирку. Получаемый на этой стадии осадок РНК можно хранить под спиртом при -70 °С.

9. Центрифугируют РНК при 14000g в течение 5 мин при комнатной температуре; отбирают супернатант, промывают осадок 80% этанолом и центрифугируют при 14000g в течение 5 мин при комнатной температуре;

10.Отбирают супернатант и подсушивают осадок в течение 2.5 мин под вакуумом;

15

11 .Растворяют осадок РНК в 300 мкл буфера 10 мМ трис, 1 мМ ЭДТА, рН8.0, добавляют 750 мкл этанола и хранят образцы при -70 °С;

12,Для получения водного раствора РНК переносят аликвоту спиртового раствора в микроцентрифужную пробирку и добавляют ЗМ ацетат натрия до конечной концентрации 0.3 М; тщательно перемешивают и инкубируют раствор при -70 °С в течение 15 мин;

13.Осадок РНК собирают центрифугированием при 14000 g в течение 10 мин при 4 °С; промывают осадок 80% этанолом, высушивают его под вакуумом и растворяют в буфере 10 мМ трис, 1 мМ ЭДТА, рГО.О

ВЫДЕЛЕНИЕ РНК ИЗ ОГРАНИЧЕННОГО КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК

Сравнительно быстро после разработки метода ПЦР для амплификации ДНК, появилась экспериментальная работа о возможности использования молекулы мРНК (Chelly J. et al., 1988) для получения кДНК. Данный метод был назван RT-ПЦР (reverse transcription - обратно транскриптазная) и заключается в синтезе кДНК на матрице мРНК с помощью обратнотранскриптазной реакции и далее осуществляется стандартная ПЦР. Преимущества RT-ПЦР заключаются в возможности диагностики РНК-содержащих вирусов на ранних этапах инфекции, определении уровня мРНК в экспрессирующихся тканях, и создании библиотек кДНК. В то же время выделение матричных РНК, имеющих непродолжительный период существования, малое количество копий из ограниченного экспериментального материала очень часто является лимитирующим фактором при проведении RT-ПЦР. Данный метод является модификацией ряда процедур выделения РНК и может использоваться для получения РНК с высоким выходом из клеточных культур и биопсийного материала.

1. Клетки в количестве 5-1000 отмывают дважды стерильным ФСБ (150 мМ NaCl, 20 мМ фосфат натрия, рН7.5) и собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин.

2. Клетки ресуспендируют в 30 мкл 2 мМ дитиотреэтола (ДТТ) и лизируют при 95 °С в течение 30-60 сек.

3. Немедленно после лизиса клеток при интенсивном перемешивании на вортексе добавляется 1 мкл (20-40 ед.) РНКазина (ингибитора РНКаз), 5 мкл 0.5 М трис-HCl, рН 7.5, 0.02 М СаС1₂, 5 мкл 0.2 М MgCl₂ и 1 мкл (2-10ед)ДНКазы.

4. ДНК гидролизуется при 37 °С в течение 15 мин и добавляется ЭДТА, SDS, протеиназа К до конечных концентраций 20 мМ, 0.5% и 1 мг/мл

16

соответственно. ДНКаза и клеточные белки подвергаются деградации в течение 15 мин при 37 °С.

5. РНК экстрагируется один раз равным объемом смеси водонасыщенного фенола/хлороформа (1:1), рНб.О и дважды смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24:1).

6. РНК осаждают добавлением 0.1 объема 3 М ацетата натрия рН 5.4 и трех объемов охлажденного до —70 °С этанола в присутствии 1-2 мкг гликогена как носителя, выдерживают 20 мин при -70 °С.

7. РНК собирают центрифугированием в течение 10 мин при 13000 об/мин, дважды отмывают 70 % этанолом в течение 1-2 мин и снова собирают осадок центрифугированием.

8. Удаляют этанол, подсушивают осадок и РНК растворяют в 20 мкл стерильной деионизованной воды (обработанной ДЭПК), раствор РНК хранят при -70 °С.