Постановка пцр
Так как объем одной пробы в ПЦР составляет от 10 до 100 мкл, удобно предварительно смешать в одной пробирке все компоненты реакционной смеси, за исключением анализируемого генетического материала и минерального масла. В следующей таблице представлена схема расчета постановки ПЦР объемом 25мкл для амплификации фрагмента гена pY(D17S30):
Компоненты |
исходная концентрация |
необходимая концентрация в пробе |
количество мкл на 1 пробу объемом 25 мкл |
количество мкл на 5 проб |
количество мкл на 10 проб |
1. Н2О |
|
|
11.8 |
59 |
118 |
2. dNTP |
2.0 мМ |
0.2 мМ |
2.5 |
12.5 |
25 |
3. MgCl2 |
40 мМ |
1.6 мМ |
1.0 |
5 |
10 |
4. 5Хбуфер |
5Х |
IX |
5.0 |
25 |
50 |
5. Taq |
5 ед/мкл |
1ед |
0.2 |
1 |
2 |
6. праймеры |
5 мкМ |
0.5 мкМ |
2.5 |
12.5 |
25 |
7. ДНК |
|
|
2 |
добавляется в каждую пробирку индивидуальный образец по 2 мкл |
|
|
|
|
|
|
|
Праймеры для амплификации участка гена pY(D17S30): 5 '-CGAAGAGTGAAGTGCACAGG-3' 5 '-С ACAGTCTTTATTTCTTCAGCG-3'
-
Рассчитать состав реакционной смеси на количество анализируемых проб + две пробы для отрицательного и положительного контролей + 1 проба, учитывающая возможную неточность автоматических пипеток.
-
Пронумеровать одноразовые пробирки для ПЦР (объемом на 0.2 или 0.5 мл). Количество пробирок соответствует числу анализируемых проб + две пробирки для отрицательного и положительного контролей.
-
Внести в пробирку компоненты реакционной смеси в следующей последовательности: деионизованная вода, dNTP, MgCl2, 5Хбуфер, Taq-полимераза. При переходе от одного компонента к другому обязательно менять наконечники. Тщательно перемешать пипетированием, избегая вспенивания и образования аэрозолей. Добавить праймеры и еще раз осторожно перемешать содержимое пробирки.
22
-
Приготовленную реакционную смесь разлить по 23 мкл в пронумерованные пробирки для ПЦР.
-
В отрицательный контроль добавить 2 мкл дистиллированной воды.
-
В анализируемые пробы добавить по 2 мкл анализируемых образцов генетического материала, перемешать наконечником. При переходе от одной пробирке к другой обязательно менять наконечник.
-
Добавить по 1 капле минерального масла (объемом 30-40 мкл), масло осторожно наносится на стенку пробирки, при этом наконечник не должен касаться стенки пробирки. Тщательно закрыть пробирки.
-
В положительный контроль под слой масла добавить образец контрольной ДНК, сбросить наконечник.
-
Поставить пробирки в амплификатор.
Ю.Включить выбранную программу амплификации. При использовании модифицированной ДНК-полимеразы на первом этапе необходимо прогреть пробы 3 мин при 94 "С для активации полимеразы, затем запустить программу. Например, для амплификации участка гена pY используется следующий температурный режим: 94 °С - 1 мин; 51 °С -1.5 мин; 72 °С - 2 мин, количество циклов - 35.
ОЦЕНКА ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ
Смесь амплифицированных фрагментов ДНК, образовавшуюся в результате ПЦР анализируют с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях (ПААГ). Выбор метода электрофореза определяется следующими обстоятельствами: ПААГ обладает большей разрешающей способностью, чем агарозный, поэтому ПААГ предпочтительнее использовать при исследовании локусов, в которых близкие аллельные варианты имеют лишь незначительную разницу в длине последовательностей. Например, соседние аллели локуса АроВ отличаются друг от друга только на 16 нуклеотидов и поэтому результат их разделения в агарозном геле буде нечетким, в этом случае предпочтительнее использовать ПААГ. В то же время аллели локуса D1S80 отличаются друг от друга на 70 нуклеотидов и поэтому могут быть легко дифференцированы в агарозном геле. Теоретически целесообразно при типировании любого локуса начинать с пробного электрофоретического разделения в агарозном геле. Результаты его позволяют сориентироваться и определиться в необходимости проведения более сложного и трудоемкого электрофореза в ПААГ. Пробный электрофорез предназначен прежде всего для того, чтобы удостовериться, что в исследуемых объектах выявляются амплифицированные фрагменты и что данная ПЦР-система работает специфично. Результат реакции может позволить сделать вывод и без дополнительного исследования с
23
помощью ПААГ. При необходимости лучшего разделения амшшфикатов для уточнения результатов следует дополнить исследование гель-электрофорезом в ПААГ с последующим окрашиванием бромистым этидием или серебром. В том случае если ПЦР проводится с диагностической целью для исследования наличия или отсутствия чужеродного генетического материала, то проводится электрофорез в 2%-агарозном геле. По окончании электрофореза можно судить о присутствии в анализируемом образце исследуемой ДНК.