Необходимые приборы и реактивы:

• ДНК-амплификатор (термоциклер) - прибор, обеспечивающий циклическую смену температур по заданной программе; выпускаемые в настоящее время термоциклеры рассчитаны на одновременное проведение до 96 реакций и могут осуществлять нагрев как нижней платформы, так и верхней платформы, через крышку прибора, что исключает применение минерального масла в реакции.

• стандартный набор лабораторного оборудования для выделения генетического материала из исследуемых образцов, постановки электрофореза в агарозном и полиакриламидном геле (центрифуга типа "Eppendorf", вортекс, автоматические пипетки объемом 2,5-200 мкл, источник питания, электрофоретические камеры, трансиллюминатор), одноразовые наконечники и пробирки для ПЦР.

• термостабильная ДНК-полимераза; установлено, что для Taq полимеразы Т_]/2 активности = 2 часа при 92.5 °С;

40 мин при 95 °С; 5 мин при 97,5 °С;

+ 10% глицерина 23 мин при 97 °С, в то же время в ряде работ отмечается, что глицерин может ингибировать ПЦР.

• дезоксинуклеозидтрифосфаты - dNTP, готовится исходный ЮмМ раствор, рН 7.0, содержащий в равной концентрации dATP, dGTP, dCTP, dTTP; избыток в реакционной смеси одного из dNTP может приводить к неправильному спариванию нуклеотидов при прохождении реакции. После проведения 50 циклов амплификации в реакционой смеси остается 50% не вступивших в реакцию dNTP. Теоретические расчеты показывают, что 20uM dNTP требуется на 100 jo.1 реакционной смеси, что приведет к образованию 2,6 иг продукта, на фрагмент длиной 400 оснований затрачивается 10 рМ .

• олигонуклеотидный праймер - является ключевым моментом в постановке ПЦР, связано это с тем, что от его выбора зависит специфичность проведения ПЦР. Концентрация каждого праймера составляет 0,2-1цМ. Необходимым условием для успешного протекания ПЦР является знание нуклеотидной последовательности по 3'-концам амплифицируемой области на прямой и обратной нитях ДНК соответственно; длина праймеров составляет от 15 до 30 нуклеотидов. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез ДНК протекает только между ними, удваивая количество копий между ними. Олигонуклеотидные праймеры должны быть комплементарны противоположным цепям ДНК, т.е. синтезируют "прямой" и "обратный" праймеры. Праймеры подбираются к консервативным участкам

20

исследуемой ДНК, которая мало подвержена генетическим изменениям. Например, выбор в качестве мишени гена groEL микобактерий позволит зарегистрировать в образце представителей любого из порядка 30 видов рода Micobacteria; праймеры, комплементарные последовательности IS986 или IS6110, выявят представителей любого из четырех видов возбудителей туберкулеза человека, относящихся к Micobacterium tuberculosis complex, праймеры к IS900 выявят единственный вид - Micobacterium paratuberculosis. При выборе праймера необходимо учитывать следующие условия:

1. праймеры не должны: образовывать вторичную структуру, иметь внутреннюю и внешнюю гомологию между собой;

2. содержание GC « 50 % и случайное распределение оснований; следует избегать праймеров с протяженными полипуриновыми или полипиримидиновыми основаниями.

3. праймер со стороны 3'-конца должен быть стабильным и содержать не более трех G/C оснований, так как большее их количество может привести образованию димеров.

Для подбора праймеров удобно пользоваться компьютерными программами и базами данных о нуклеотидных последовательностях, расположенных на сайтах: http://www.hgmp.mrc.ac.uk;

http://www.ddbj.nig.ac.jp; http://www.ebi.ac.uk;

• реакционный буфер: 50 мМ КС1; 20 мМ трис-HCl, рН 8.3; 0.05% твин- 20; 100 цг/мл желатина. Рассмотрим необходимость каждого компонента в реакционной смеси: КС1 - создает ионную силу, облегчает отжиг праймера, вместо КС1 можно использовать NH4CI; NaCl - ингибирует ПЦР. Твин-20 необходим для инактивации ингибирующего действия SDS, используемого для выделения генетического материала; присутствие 0.01% SDS-Na достаточно для блокирования ПЦР. Желатин необходим для стабилизации ДНК-полимеразы.

• Для оптимизации условий ПЦР важное значение имеет подбор концентрации Mg²⁺. Связано это с тем, что Mg²⁺ является не только активатором ДНК-полимеразы, но влияет также на такие процессы как отжиг праймера, денатурацию двунитевой ДНК, специфичность и точность продуктов амплификации. Избыток Mg²⁺ вызывает накопление неспецифических продуктов амплификации, а недостаток - уменьшение выхода амплифицированных фрагментов. Обычно в реакции концентрация MgC^ находится в пределах 0.5-5 мМ. Необходимо также помнить, что присутствие ЭДТА в образцах исследуемой ДНК может несколько изменять установленный оптимум.

21

• минеральное масло - применяется для предотвращения испарения проб в момент нагрева, необходимо в случае использования ПЦР-амплификаторов с нижней нагревающей платформой.