Модификации пцр

Существуют различные модификации ПЦР, которые используются в зависимости от конкретных целей проведения реакции или от характера последующего молекулярного анализа амплификатов.

ПЦР "горячего старта" - "Hot Start PCR". Данный метод заключается в физическом разделении компонентов реакционной смеси таким образом, чтобы реакция начиналась только после проведения в амплификаторе первого этапа денатурации ДНК. Связано это с тем, чтобы избежать неспецифической гибридизации праймеров с исследуемой ДНК, праймеров между собой, что может произойти в момент смешения комопонентов при постановке реакции. Другими словами, "горячий старт" предотвращает отжиг праймеров на самом первом этапе изменения температуры от комнатной до температуры денатурации. Используется три основных приемы :

1. готовится реакционная смесь, содержащая все компоненты за исключением Taq-полимеразы, разносится по пробиркам, разливается масло, устанавливается в амплификатор, после первого этапа денатурации ДНК в пробирки под слой масла вносится Taq-полимераза.

2. В пробирке создается физический барьер из легкоплавкого воска ( с температурой плавления и 45 °С), препятствующий контакту между собой компонентов реакционной смеси при комнатной температуре. В

27

момент повышения температуры в амплификаторе воск плавится и не препятствует дальнейшему проведению ПЦР.

3. Использование модифицированной ДНК-полимеразы. Наиболее удачным методом решения проблемы "горячего старта" является использование модифицированной ДНК-полимеразы, не активной при температурах ниже 55 °С.

"Точная" ПЦР- "Touch down" PCR. Суть модификации заключается в том, что первая реакция отжига выполняется при температуре, которая на 15 °С выше, чем вычисленная температура плавления праймеров и затем уменьшается на 1-2 °С после каждого второго цикла до тех пор, пока не будет достигнута температура плавления. Во время градиентного уменьшения температуры отжига, "желательные" (обязательно праймированные) продукты ПЦР накапливаются в противовес "нежелательным" неспецифическим продуктам. На второй фазе "touch down" ПЦР, во время постоянной температуры отжига предпочтительно амплифицируются "желательные" продукты. Хотя накопление и амплификация побочных продуктов данной модификацией метода не исключается, этот вариант ПЦР очень часто применяется как альтернатива метода "горячего старта".

"Гнездовая" ПЦР - "nested" PCR. Применяется в тех случаях, когда количество исследуемой ДНК очень мало, а также для трудно амплифицируемых участков ДНК (содержащих различные повторяющиеся последовательности или необычные структурные элементы). ПЦР проводится в два этапа. На первом этапе проводится обычная ПЦР с подобранными высокоспецифичными праймерами, на втором этапе продукт ПЦР - амплифицированную ДНК подвергают вторичной амплификации с использованием второй пары, так называемых, "внутренних" праймеров. Специфичность реакции увеличивается благодаря использованию второй пары праймеров, так как неспецифически амплифицированные продукты первого этапа элиминируются из циклов амплификации на втором этапе.

PCR in situ. Реакцию амплификации можно проводить не только в растворе, но и непосредственно на хромосомных препаратах единственной клетки, полученной в результате микроманипуляций. Данная модификация, в комбинации с nested-праймерами, часто применяется в пренатальной диагностике.

RAPD-PCR. (Random Amplified Polymorohic DNA) - амплификация ДНК со случайными, короткими праймерами, не являющимися

28

компонентами генов, но распределенные в геноме в районе повторяющихся последовательностей. Полученная в результате картина электрофоретического распределения продуктов ПЦР будет индивидуальна для каждого организма или индивида.

ПЦР длинных фрагментов — Long PCR. Благодаря внесению ряда кардинальных усовершенствований, таких как особый подбор праймеров, использование двух различных ДНК-полимераз одновременно, (одна из которых обладает редактирующей активностью), температурных условий полимеризации, (уменьшением те:мпертуры денатурации до нескольких секунд, что приводило к уменьшению депуринизации ДНК при высоких температурах), применение триц,инового буфера, стало возможным проведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих длинной 35 000 пар оснований.

ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ В

ЛАБОРАТОРИЯХ, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ МЕТОД ПОЛИМЕРАЗНОЙ

ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Благодаря высокой чувствительности метод ПЦР требует специально оборудованных помещений и тщательного соблюдения техники безопасности во избежании контаминации. Попадание в реакционную пробирку следовых количеств положительной ДНК приводит к амплификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, ложно-положительных результатов.

Основными видами контаминации при проведении ПЦР, являются следующие:

• перекрестная контаминация от пробы к пробе ( в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению ложно-положительных результатов; поэтому необходимо менять наконечники при переходе от одной пробирки к другой.

• контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, так как в процессе ПЦР амшгаконы накапливаются в огромных: количествах, легко переносятся аэрозольным путем и являются идеальными продуктами для реамплификации. По некоторым оценкам количество амплифицированных молекул составляет 6 млрд/мкл и одна капля аэрозоля может содержать до 24000 копий амплификата. Аэрозоли могут образовываться при встряхивании пробирок на вортексе,

29

открывании микроцентрифужных пробирок, работе с микродозаторами и центрифугировании в вакууме. Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток, лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов, кожи сотрудников лаборатории приводят к появлению систематических ложно-положительных результатов.

Как правило, определить источник контаминации бывает очень трудно, требуются значительные затраты времени и средств. Во всех случаях контролем для ложноположительной реакции является отсутствие положительного сигнала в пробе с заведомо отсутствующей исследуемой ДНК. Отрицательный контрольный образец должен проходить те же стадии обработки, что и клинические образцы.

Ложноотрицательный результат может быть вызван наличием ингибиторов реакции, недостаточной чувствительностью реакции, ошибками при выделении ДНК и др. Поэтому в каждой серии анализов должен присутствовать положительный контроль - образец с заведомым присутствием участка ДНК для данных праймеров.

Лаборатория, где проводится ПЦР требует территориального разделения на три зоны для выполнения отдельных процедур.

• первая зона предназначена для приготовления ПЦР-реактивов;

• во второй зоне проводится выделение ДНК из клинических образцов и постановка ПЦР;

В первой и второй зонах запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты и т.д.), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.

• третья зона предназначена для детекции продуктов амплификации;

В третьей зоне допускается использовать другие методы детекции генетического материала, диагностика которых проводится в данной лаборатории.

Зону детекции продуктов амплификации следует располагать как можно дальше от первых двух зон и исключить движение воздушного потока из третьей зоны в первую и вторую зоны. Работа в лаборатории должна быть организована в одном направлении: от первой зоны, к третьей.

Каждая зона лаборатории, где проводится ПЦР, должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящихся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, расходные материалы в каждой зоне

30

должны иметь соответствующую маркировку. Обработка рабочей одежды из каждой зоны должна производится раздельно. Необходимо однократно использовать пробирки и наконечники для автоматических пипеток; обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК или при раскапывании реакционной смеси.

Биологические образцы для выделения генетического материала должны храниться отдельно от набора реагентов для проведения ПЦР.

Не следует использовать водяные бани, т.к. заполняющая их вода, просачиваясь в недостаточно плотно закрытые пробирки, может стать источником контаминации; следует использовать суховоздушные термостаты.

При исследовании материала зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-IV групп, работа должна проводиться с соблюдением "Санитарных правил СП 1.2.011-94 (Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности)" и "Положения о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, рикетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения", М., 1980.

Необходимо постоянно поддерживать чистоту на рабочем месте:

• каждое помещение должно иметь свой отдельный набор инвентаря для обработки и уборки рабочего места (ватно-марлевые тампоны, пинцет, 70% этанол, дезинфицирующий раствор и т.д.), источники ультрафиолетового излучения, эффективно инактивирующие ДНК- матрицы;

• при манипуляциях с клиническим материалом рабочую поверхность до и после исследования обрабатывают дезинфицирующим раствором, затем 70% этанолом;

Следует полностью исключить проведение в ПЦР-лаборатории работ, связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей, диагностирующихся в данной лаборатории.

Персонал, работающий в ПЦР-лаборатории должен пройти соответствующее обучение.

31

ТРЕБОВАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ ПЦР-АНАЛИЗА

Забор клинических образцов должен проводиться только в одноразовые пластиковые пробирки; работать в одноразовых перчатках. Необходимо использовать для автоматических пипеток одноразовые наконечники с аэрозольным барьером; обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой. Использованные пробирки и наконечники должны сбрасываться в специальную емкость с раствором, вызывающим деградацию ДНК (1 н НС1; 10% гипохлорит натрия или 10% хорной извести).

При постановке анализов, следует готовить смесь реактивов для ПЦР, рассчитанную на все пробы, включая контрольные, а затем раскапывать ее по пробиркам. Избегать вспенивания, образования аэрозолей во время шшетирования и центрифугирования. В каждый данный момент времени работать только с одной пробиркой, все остальные должны быть закрыты крышками. В момент открывания и закрывания пробирок не прикасаться к внутренней поверхности крышки руками и наконечниками пипеток. Во всех случаях постановки ПЦР следует применять отрицательные и положительные контроли в соответствии с инструкцией по применению диагностических наборов.

Анализ продуктов ПЦР должен производиться в изолированном помещении сотрудником лаборатории, не производящим обработки клинических образцов и операций с реакционной смесью. Оборудование, реактивы, халаты и т.д. данного помещения должны находится только в этой комнате и не попадать в другие лаборатории ПЦР-диагностики. Следует всегда помнить, что самым опасным местом контаминации продуктами ПЦР амплификации является зона, где проводится электрофоретический анализ и детекция результатов реакции.

Рабочие поверхности, оборудование и материалы следует облучать ультрафиолетом с максимумом излучения в области 260нм; облучение необходимо проводить в течение 1 часа до начала работы и в течение 1 часа после окончания работы.

-

32

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Льюин Б. /Гены - М: Мир. -1987. - С. 3-317.

2. Баев А. А-. Программа "Геном человека", ее возникновение, содержание и развитие// Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Геном человека. - 1990.-Т.1.-С. 4-33.

3. Маниатис М., Фрич Э., Сэмбрук Дж. / Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование.-1983.-с. 157-180.

4. Молекулярно-клиническая диагностика. Методы. /М: Мир.-1999.- С.302-328, С.507-532

5. Горбунова В.Н., Баранов В.С./Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний.-Спб. Специальная литература.-1997.-287 с.

6. Иванов П. Л. др. Применение геномной "дактилоскопии" для диагностика монозиготности близнецов// Судебно-медицинская экспертиза - 1991 -. N.1. - С. 30-33.

7. Моляка Ю. К. и др. Генотипоскопия ДНК в определении спорного отцовства: использование гибридиционных зондов// Генетика. - 1997. - т. 33.-N. 6.-С. 831-835.

8. Пузырев В. П. Геномные исследования и болезни человека// Соросовский образовательный журнал. - 1996. - №. 5. - С. 19-28.

9. Рогаев Е. И. и др. Сравнение последовательностей митохондриальной ДНК Т. Н. Куликовского- Романова, племянника царя НиколаяП Романова, и ДНК предполагаемых останков царя// Генетика. - 1996. - т. 32.-№. 12.-С. 1690-1692.

10.Рысков А. П. Геномная "дактилоскопия"//Информационый бюллютень:

"Геном человека". -М.: 1990. - № 3.- 46 с. 11 .Янковский Н. К. Молекулярно-генетические методы в руках детектива,

или опыт исследования останков семьи последнего Российского

императора// Соросовский образовательный журнал. - 1996. - № 2. - с.

21-28. 12.Чемерис А.В., Ахунов А.Д., Вахитов В.А./Секвенирование ДНК.-

М.Наука,-1999.-429с. 13.Majumder. DNA fingerprinting for forensic identification: Some statistical

issues // Elecnrophoresis. - 1995. - v. 16. - p. 1684-1688 14.Miesfeld R., Rrystal M., and Arnheim N. A member of a new repeated

sequence family which is conserved throughout eucaryotic evolution is found

between the human delta and beta globin genes// Nucleic Acids Res.- 1981.-

v. 9.-p. 5931-5947. 15.ThePCRTechnique: RT-PCR/BioTechniquesBooks.-1998-300с

33

СОДЕРЖАНИЕ

ОСНОВНЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ДНК 3

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 8

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК 8

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ОБРАЗЦОВ ПЕРЕФИРЕЧЕСКОЙ КРОВИ... 8 ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК В СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКИХ

ИССЛЕДОВАНИЯХ 10

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ КРОВЯНОГО СГУСТКА 11

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ПЯТЕН КРОВИ: ПРЯМОЙ ЛИЗИС 11

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ПЯТЕН 12

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ КОРНЕЙ ВОЛОС 12

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ КРОВИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ CHELEX .. 13

ВЫДЕЛЕНИЕ РНК 13

ВЫДЕЛЕНИЕ РНК С ПОМОЩЬЮ ГУАНИДИНТИОЦИАНАТА. ... 14

ВЫДЕЛЕНИЕ РНК ИЗ ОГРАНИЧЕННОГО КОЛИЧЕСТВА

КЛЕТОК 16

■

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ 17

НЕОБХОДИМЫЕ ПРИБОРЫ И РЕАКТИВЫ 20

ПОСТАНОВКА ПЦР 22

ОЦЕНКА ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ 23

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В АГАРОЗНОМГЕЛЕ 24

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ 25

ОКРАШИВАНИЕ ПААГ НИТРАТОМ СЕРЕБРА 26

МОДИФИКАЦИИ ПЦР 27

ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ .... 29 ТРЕБОВАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ ПЦР-АНАЛИЗА 32