Полимер азная цепная реакция

Предложенный в 1983 году американским биохимиком Кэрри Маллисом метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в корне изменил подход в молекулярной диагностике наследственных и инфекционных заболеваний, судебно-медицинской экспертизе вещественных доказательств, установлении родства и анализе родословных, систематике микроорганизмов, растений, животных и т.д. За изобретение ПЦР К.Маллис в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии. Анализ данных литературы показывает, что в ближайшие пять лет применением ПЦР-технологии увеличится в среднем на 500 %.

В основе метода ПЦР лежит способ избирательного размножения в геометрической прогрессии отдельных участков ДНК, длиной от нескольких десятков, до нескольких нескольких сотен пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые образцы ДНК или РНК. Главным фактором, определившим широкое применение ПЦР, является принципиальная возможность неограниченной амплификации фрагментов ДНК и точная детекция образовавшегося продукта. Эффективность ПЦР не имеет себе равных: за два-три часа с одной молекулы ДНК или РНК может быть получено несколько миллионов копий исследуемого фрагмента. Теоретически при использовании для амплификации X фрагментов ДНК, через 30 циклов реакции может быть получено Х«2³⁰ идентичных копий исходной ДНК. Хотя практическая эффективность реакции несколько отличается от теоретической, и она несколько выше после первых циклов амплификации, чем на последних циклах, все же

17

образующегося количества ДНК достаточно для проведения дальнейших исследований.

Полимеразная цепная реакция заключается в повторяющихся циклах трех основных реакций:

1. Денатурация ДНК. двунитевые молекулы нагреваются до температуры плавления, т.е. разделяются на две однонитевые молекулы. На этой стадии требуется нагрев до температуры 92 - 96 °С в течение 30 -90 сек.

2. Гибридизация или отжиг праймера: искусственно синтезированные к исследуемому фрагменту ДНК олигонуклеотиды - праймеры, гибридизуются с комплементарными участками однонитевых фрагментов ДНК; праймеры служат затравками для последующего синтеза ДНК. Реакция зависит от последовательности оснований, длины и концентрации праймера и, как правило, протекает в интервале температур от 37 °С до 68 °С, продолжительность составляет 40 - 90 сек. Грубый подсчет температуры плавления праймеров может быть проведен вручную с помощью формулы: Tm=4°C(G+C)+2°C(A+T) -5°C, хотя, считается, что данная формула справедлива лишь для относительно коротких праймеров длиной до 20 нуклеотидов. Для более точного определения температуры плавления олигонуклеотидов в расчет принимают не только сами основания, но и их ближайшее окружение, что может быть проведено с помощью специализированных компьютерных программ, в частности программы "Oligo". Следует только помнить, что температура отжига должна быть одинаковой для обоих праймеров.

3. Элонгация: как правило, синтез новой нити ДНК происходит при температуре 70-75°С - оптимальная температура для ДНК-полимераз из бактерий Thermus aquaticus (Taq) и Thermus thermophilus (Tth). ДНК- полимеразы достраивают полинуклеотидные нити с гибридизованных праймеров, используя дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP), находящиеся в реакционной смеси. Термостабильные ДНК-полимеразы синтезируют последовательность ДНК длиной 1000 нуклеотидов за 1 минуту. Продолжительность этапа элонгации составляет 30-90 сек. Конечным продуктом реакции являются двунитевые молекулы ДНК.

18

После проведения всех трех реакций - завершается первый цикл; длительность одного цикла находится в пределах 2-4 мин. Для возобновления процесса и начала нового цикла необходимо наличие в реакционной смеси однонитевых молекул ДНК, что достигается кратковременным повышением температуры до 92 - 96°С, таким образом цикл повторяется снова.

В первом цикле праймеры гибридизуются с исходной матричной молекулой ДНК, а затем и с вновь синтезированными молекулами ДНК по мере их накопления в растворе. В этом случае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифицированного участка, что и определяет в конечном счете, размер вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного нуклеотида.

Таким образом, начиная с третьего цикла, накопление целевых амплификатов происходит экспоненциально, тогда как количество гетерогенных амплификатов, ограниченных праймерами только с одного конца молекулы ДНК накапливается только в арифметической прогрессии.

целевые молекулы	циклы
3.0 хЮ^5	25-	-30
1,5 хЮ^4	30-	-35
1,1 хЮ^3	35-	-40
50	40-	-45
<50,	20-	-30
требуется проведение
второго анализа с
внутренними праймерами
(nested-ПЦР) 30-40 циклов

19