6 курс / Кардиология / Хоффман,_Кампс_Лечение_ВИЧ_инфекции,_2009

2 Антиретровирусная терапия

В настоящее время результаты нескольких исследований положили конец долгим спорам, предоставив доказательства, что TDF действительно вызывает токсическое повреждение митохондрий в ткани почек. TDF (тенофовир) — нуклеотидный ингибитор обратной транскриптазы (Вирид®). Сообщалось о случаях нарушения функции почек, синдрома Фанкони и остеомаляции у животных (Tenofovir review team, 2001) и пациентов (Gupta, 2008; Wanner, 2009), получавших тенофовир. У пациентов, получающих TDF, часто обнаруживаются повышение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови и гипофосфатемия вследствие уменьшения реабсорбции фосфатов в почках (Kinai, 2005). Кроме того, у пациентов, получавших тенофовир, наблюдалась остеомаляция, особенно при приеме тенофовира в комбинации с LPV/r (Parsonage, 2005; Wanner, 2009). TDF реабсорбируется в проксимальных почечных канальцах с помощью человеческих транспортных белков 1-го и 3-го типов для переноса органических анионов (hOAT-1 и hOAT-3). Несмотря на то, что TDF является слабым ингибитором гамма-полимеразы, белкипереносчики hOAT-1 и hOAT-3 способны создать достаточно высокую концентрацию тенофовира в клетках эпителия почечных канальцев, чтобы произошло значимое угнетение синтеза мтДНК (Cote, 2006). Сниженные уровни мтДНК обнаруживались в почечных биоптатах пациентов, получавших TDF+ddI — комбинацию НИОТ, которая больше не рекомендуется к применению (Cote, 2006). У крыс тенофовир вызывал органоспецифическое токсическое поражение почек со снижением концентрации мтДНК и нарушением функции кодируемых мтДНК субъединиц ферментов дыхательной цепи (Lebrecht, 2009). В связи с вышеизложенным не рекомендуется назначать тенофовир пациентам с нарушениями функции почек.

При применении зидовудина для профилактики вертикальной передачи ВИЧ наблюдается снижение концентраций мтДНК в плаценте, а также в пуповинной крови новорожденных, чьи матери получали зидовудин в перинатальном периоде (Divi, 2004, Shiramizu, 2003; Gingelmaier, 2009). У детенышей, родившихся от обезьян, получавших комбинацию зидовудина с ламивудином до родов, зидовудин был обнаружен в составе мтДНК. Кроме того, было обнаружено снижение уровня мтДНК в скелетных мышцах, сердце и головном мозге новорожденных обезьян (Gerschenson, 2004); в некоторых животных моделях перинатально возникшие нарушения сохранялись в течение нескольких месяцев после отмены НИОТ.

Обнаружена повышенная частота митохондриальных симптомов и патологических изменений ткани головного мозга, обнаруживаемых с помощью визуальных методов исследования у детей, рожденных женщинами, получавшими НИОТ во время беременности (Blanche, 1999; Tardieu, 2005). Нередко у новорожденных обнаруживается гиперлактатемия; иногда она сохраняется в течение нескольких месяцев после рождения (Noguera, 2003). Другие клинические исследования не выявили повышенного риска при перинатальной профилактике зидовудином, однако ключевые показатели токсического поражения митохондрий в них не оценивались. Необходимо срочно провести анализ отдаленных данных (Venhoff, 2006). Тем не менее, полученной на сегодняшний день информации недостаточно, чтобы отказаться от действующих рекомендаций по применению зидовудина для профилактики вертикальной передачи ВИЧ в составе комбинированной схемы АРТ для матери.

Наблюдение

На сегодняшний день не существует надежных методов оценки индивидуального риска токсического повреждения митохондрий. Регулярное определение уровня лактата всем получающим НИОТ пациентам в отсутствие симптомов не обосновано, поскольку повышенный уровень лактата в отсутствие симптомов не служит прогностическим фактором клинически значимого токсического повреждения митохондрий (McComsey, 2004 г). Определение уровня мтДНК в мононуклеарах периферической крови ненадежно. По-видимому, более чувствительным методом является определение уровня мтДНК в пораженных тканях, однако этот метод подразумевает проведение инвазивного вмешательства, и он не оценивался в проспективных исследованиях с точки зрения клинических исходов.

При установившейся симптоматике в диагностике помогает гистологическое исследование биоптатов. В пользу токсического повреждения митохондрий свидетельствуют: ультраструктурные изменения митохондрий, сниженная гистохимическая активность цитохром-c-окси- дазы, внутриклеточная (особенно мелкокапельная) жировая дистрофия печени и так называемые «рваные красные мышечные волокна».

290

Лечение и профилактика токсического повреждения митохондрий

Лекарственные взаимодействия

Лекарственные взаимодействия могут усиливать проявления токсического повреждения митохондрий и должны приниматься во внимание. Токсическое действие диданозина на митохондрии, например, усиливается в результате лекарственных взаимодействий с рибавирином, гидроксимочевиной и аллопуринолом (Ray, 2004). В случае комбинирования диданозина с тенофовиром дозу диданозина нужно снизить до 250 мг 1 раз в сутки. Аналог тимидина бривудин — виростатик для лечения герпетической инфекции — способен усиливать токсическое действие НИОТ на митохондрии, поскольку один из его метаболитов оказывает ингибирующее действие на ДГОДГ (см. ниже). Поэтому бривудин не следует назначать одновременно с антиретровирусными препаратами-аналогами пиримидинов.

Токсины для митохондрий

Метаболизм митохондрий нарушают также ибупрофен, вальпроевая кислота и аспирин, поскольку эти препараты подавляют утилизацию митохондриями жирных кислот. Неоднократно сообщалось о случаях развития угрожающего жизни лактацидоза, спровоцированного приемом вальпроевой кислоты, как у ВИЧ-инфицированных пациентов, так и у лиц с врожденными мутациями мтДНК. Аспирин может повреждать митохондрии; при повреждении митохондрий гепатоцитов печени может развиться синдром Рея. Амиодарон и тамоксифен подавляют синтез АТФ в митохондриях. Парацетамол и другие препараты ослабляют антиоксидантную защиту (глутатион) митохондрий, которые становятся уязвимыми перед свободными радикалами. Аминогликозидные антибиотики и хлорамфеникол не только подавляют синтез белков бактериями, но и при определенных обстоятельствах могут нарушать транскрипцию пептидов в митохондриях как в бактериоподобных эндосимбионтах клетки. Адефовир и цидофовир тоже подавляют активность гамма-полимеразы. Алкоголь токсичен для митохондрий и поэтому от него настоятельно рекомендуется отказаться.

Возможно, наиболее важное лечебное вмешательство — отмена НИОТ, вызвавших токсическое повреждение митохондрий. Результаты нескольких исследований показали, что замена ставудина (Зерит®) на менее токсичный препарат приводит к объективному уменьшению липоатрофии с положительной динамикой (Martin, 2004; McComsey, 2004; Moyle, 2004). Напротив, замена ингибиторов протеазы на ННИОТ к уменьшению липоатрофии не приводила. Эти данные подчеркивают важную роль токсического повреждения митохондрий в патогенезе нарушений распределения жировой клетчатки.

Уридин

На сегодняшний день добавление к лечению уридина в случаях, когда невозможно отменить прием токсичных НИОТ, представляется очень перспективным методом лечения токсического повреждения митохондрий. Как уже говорилось, любое нарушение в дыхательной цепи приводит к ингибированию ДГОДГ — фермента, необходимого для синтеза уридина и его производных — пиримидинов (см. рис. 9.2). Снижение внутриклеточного содержания пиримидинов приводит к относительному избытку экзогенных аналогов пиримидина, с которыми они конкурируют за гамма-полимеразу. Порочный круг замыкается и приводит к снижению уровня мтДНК. Профилактическое или терапевтическое использование препаратов уридина может разорвать этот круг и тем самым повысить уровень мтДНК (Setzer, 2008). Уридин устраняет в гепатоцитах все последствия снижения уровня мтДНК и нормализует образование лактата, пролиферацию клеток, скорость гибели клеток и внутриклеточное отложение жира (Walker, 2003). В адипоцитах, подвергавшихся воздействию ставудина, уридин нормализовал функцию митохондрий и жировой обмен (Walker, 2006a). По новым данным, уридин способен также предотвращать гепатотоксический эффект зальцитабина (Lebrecht, 2007) и вызываемые зидовудином миопатию (Lebrecht, 2008), кардиомиопатию и нейропатию у мышей.

Пероральная заместительная терапия уридином как предшественником пиримидина хорошо переносится, даже при применении высоких доз (Kelsen, 1997; van Groeningen, 1986). При приеме содержащей уридин пищевой добавки «Митокнол» биодоступность уридина выше более чем в 8 раз по сравнению с приемом уридина в обычной лекарственной форме (Venhoff, 2005).

291

2 9. Токсическое действие НИОТ на митохондрии

2 Антиретровирусная терапия

Ингибирование гамма-полимеразы препаратом НИОТ

Относительный избыток НИОТ	Снижение
по сравнению с	уровня мтДНК
пиримидиновыми нуклеотидами

		Митокнол
	Уменьшение пула		Нарушение функции
	пиримидинов		дыхательной цепи
	Пролиферация клеток ↓	Ингибирование
	Функция клеток ↓		Ингибирование ДГОДГ
		синтеза уридина
	Апоптоз ↑

Рис. 9.2. Предполагаемый механизм действия Митокнола (НуклеомаксXTM)

впрофилактике и лечении митохондриальной токсичности

Врандомизированном плацебо-контролируемом двойном слепом исследовании было установлено, что на фоне приема митокнола происходит увеличение подкожной жировой клетчатки у пациентов с липоатрофией, которые продолжают получать ставудин или зидовудин (Sutinen, 2007) (см. рис. 9.3). Во втором исследовании проявления липоатрофии на фоне приема митокнола регулярно оценивались пациентами и врачами по балльным шкалам. И по оценкам пациентов, и по оценкам врачей митокнол эффективно уменьшал проявления липоатрофии (McComsey, 2008).

г				GS-903
конечностях,
				TARHEEL
	1200			A5125s
				RAVE
				MITOX
на	1000			Снижение дозы ставудина
				НуклеомаксХ
ткани
	800
жировой	600
прибавка	400
Общая	200
	0
		12	24	48	104 Недели
	0

Рис. 9.3. Прибавка жировой ткани при добавлении митокнола к лечению ставудином и зидовудином (по сравнению с применением схем АРТ без НИОТ)

В моделях на животных, а также у ВИЧ-инфицированных пациентов митокнол препятствовал развитию жирового гепатоза печени, обусловленного токсическим повреждением митохондрий (Walker, 2004; Banasch, 2006; Lebrecht, 2007).

Митокнол хорошо переносится и до сих пор у него не были выявлены побочные эффекты. В одном исследовании отмечалось клинически незначимое снижение уровня ЛПВП, в то время как в другом исследовании уровень холестерина ЛПВП не менялся (McComsey, 2008). Отрицательного влияния на эффективность антиретровирусной терапии не отмечалось (Koch, 2003; McComsey, 2005; Sommadossi, 1988; Sutinen, 2007). В Европе и Северной Америке митокнол продается как пищевая добавка НуклеомаксХ (NucleomaxX®); его можно приобрести в аптеках и по интернету (www.nucleomaxX.com).

292

Гиперлактатемия

При развитии симптоматической гиперлактатемии и лактацидоза все НИОТ следует немедленно отменить (Brinkman, 2000).

Эффективность применения «витаминных коктейлей» в отношении повышения уровня мтДНК не была доказана ни в экспериментах in vitro, ни в клинических исследованиях (Venhoff, 2002; Walker, 1995). У животных и людей гиперлактатемия снижалась при приеме митокнола (Lebrecht, 2007; Sutinen, 2007). После возвращения уровня лактата к норме возможно возобновление приема НИОТ (Lonergan, 2003). Рекомендации по поддерживающему лечению гиперлактатемии и лактацидоза приведены в таблице 9.2.

Таблица 9.2. Поддерживающее лечение гиперлактатемии у ВИЧ-инфицированных небеременных взрослых

Уровень лактата 2–5 ммоль/л + симптомы	Уровень лактата >5 ммоль/л или лактацидоз
Отменить препараты, токсичные для митохондрий	Отменить НИОТ и другие препараты, токсичные для митохондрий
Можно назначить витамины и НуклеомаксX	Интенсивная терапия
(36 г х 3 раза в сутки 3 дня подряд 1 раз в месяц)	Поддерживать уровень гемоглобина >100 г/л
	Не применять сосудосуживающие средства
	Кислород
	Устранение гипогликемии
	Бикарбонат (спорно) 50–100 ммоль, если pH<7,1
	Коэнзим Q10 (100 мг х3 раза в сутки)
	Витамин C (1 г х3 раза в сутки)
	Тиамин (вит. B1, 100 мг х3 раза в сутки)
	Рибофлавин (вит. B2, 100 мг х1 раз в сутки)
	Пиридоксин (вит. B6, 60 мг х1 раз в сутки)
	L-ацетилкарнитин (1 г х3 раза в сутки)
	НуклеомаксX (36 г х3 раза в сутки до снижения уровня лактата
	до <5 ммоль/л)

Литература

Arnaudo E, Dalakas M, Shanske S, Moraes CT, DiMauro S, Schon EA. Depletion of muscle mitochondrial DNA in AIDS patients with zido- vudine-induced myopathy. Lancet 1991; 337: 508-510.

Banasch M, Goetze O, Knyhala K et al. Uridine supplementation enhances hepatic mitochondrial function in thymidine-analogue treated HIV-infected patients. AIDS 2006; 20: 1554-1556.

Becher F, Pruvost AG, Schlemmer DD et al. Significant levels of intracellular stavudine triphosphate are found in HIV-infected zidovudinetreated patients. AIDS 2003; 17: 555-561.

Blanche S, Tardieu M, Rustin P et al. Persistent mitochondrial dysfunction and perinatal exposure to antiretroviral nucleoside analogues. Lancet 1999; 354: 1084-1089.

Bonora S, Boffito M, D’Avolio A et al. Detection of stavudine concentrations in plasma of HIV-infected patients taking zidovudine. AIDS 2004; 18: 577-578.

Brinkman K, Smeitink JA, Romijn JA, Reiss P. Mitochondrial toxicity induced by nucleoside-analogue reverse-transcriptase inhibitors is a key factor in the pathogenesis of antiretroviral-therapy-related lipodystrophy. Lancet 1999; 354: 1112-1115.

Brinkman K, Vrouenraets S, Kauffman R, Weigel H, Frissen J. Treatment of nucleoside reverse transcriptase inhibitor-induced lactic acidosis. AIDS 2000; 14: 2801-2802.

Carr A, Miller J, Law M, Cooper DA. A syndrome of lipoatrophy, lactic acidaemia and liver dysfunction associated with HIV nucleoside analogue therapy: contribution to protease inhibitor-related lipodystrophy syndrome. AIDS 2000; 14: F25-F32.

Carr A, Samaras K, Burton S et al. A syndrome of peripheral lipodystrophy, hyperlipidaemia and insulin resistance in patients receiving HIV protease inhibitors. AIDS 1998; 12: F51-F58.

Cote HC, Magil AB, Harris M et al. Exploring mitochondrial nephrotoxicity as a potential mechanism of kidney dysfunction among HIV-in- fected patients on highly active antiretroviral therapy. Antivir Ther 2006; 11: 79-86.

Coté HC, Yip B, Asselin JJ et al. Mitochondrial:nuclear DNA ratios in peripheral blood cells from human immunodeficiency virus (HIV)-in- fected patients who received selected HIV antiretroviral drug regimens. J Infect Dis 2003; 187: 1972-1976.

Divi RL, Walker VE, Wade NA et al. Mitochondrial damage and DNA depletion in cord blood and umbilical cord from infants exposed in utero to Combivir. AIDS 2004; 18: 1013-1021.

Galluzzi L, Pinti M, Troiano L et al. Changes in mitochondrial RNA production in cells treated with nucleoside analogues. Antivir Ther 2005; 10: 191-195.

Gerschenson M, Nguyen V, Ewings EL et al. Mitochondrial toxicity in fetal Erythrocebus patas monkeys exposed transplacentally to zidovudine plus lamivudine. AIDS Res Hum Retroviruses 2004; 20: 91-100.

Gingelmaier A, Grubert TA, Kost BP et al. Mitochondrial toxicity in HIV type-1-exposed pregnancies in the era of highly active antiretroviral therapy. Antivir Ther 2009; 14: 331-338.

Gupta SK. Tenofovir-associated Fanconi syndrome: review of the FDA adverse event reporting system. AIDS Patient Care STDS 2008; 22: 99-103.

Kakuda TN. Pharmacology of nucleoside and nucleotide reverse transcriptase inhibitor-induced mitochondrial toxicity. Clin Ther 2000; 22: 685-708.

Kelsen DP, Martin D, O’Neil J et al. Phase I trial of PN401, an oral prodrug of uridine, to prevent toxicity from fluorouracil in patients with advanced cancer. J Clin Oncol 1997; 15: 1511-1517.

293

2 9. Токсическое действие НИОТ на митохондрии

2 Антиретровирусная терапия

Kinai E, Hanabusa H. Renal tubular toxicity associated with tenofovir assessed using urine-beta 2 microglobulin, percentage of tubular reabsorption of phosphate and alkaline phosphatase levels. AIDS 2005; 19: 2031-2033.

Koch EC, Schneider J, Weiss R, Penning B, Walker UA. Uridine excess does not interfere with the antiretroviral efficacy of nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors. Antivir Ther 2003; 8: 485-487.

Lambert JS, Seidlin M, Reichman RC et al. 2’,3’-dideoxyinosine (ddI) in patients with the acquired immunodeficiency syndrome or AIDSrelated complex. A phase I trial. N Engl J Med 1990; 322: 1333-1340.

Lebrecht D, Deveaud C, Beauvoit B, Bonnet J, Kirschner J, Walker UA. Uridine supplementation antagonizes zidovudine-induced mitochondrial myopathy and hyperlactatemia in mice. Arthritis Rheum 2008; 58: 318-326.

Lebrecht D, Vargas Infante YA, Setzer B, Kirschner J, Walker UA. Uridine supplementation antagonizes zalcitabine-induced microvesicular steatohepatitis in mice. Hepatology 2007; 15: 72-79.

Lebrecht D, Venhoff AC, Kirschner J, Wiech T, Venhoff N, Walker UA. Mitochondrial tubulopathy in tenofovir-DF treated rats. J Acquir Immune Defic Syndr 2009; 1: 258-63.

Lewis W, Day BJ, Copeland WC. Mitochondrial toxicity of NRTI antiviral drugs: an integrated cellular perspective. Nature Reviews Drug Discovery 2003; 2: 812-822.

Löffler M, Jöckel J, Schuster G, Becker C. Dihydroorotat-ubiquinone oxidoreductase links mitochondria in the biosynthesis of pyrimidine nucleotides. Mol Cell Biochem 1997; 174: 125-129.

Lonergan JT, Barber RE, Mathews WC. Safety and efficacy of switching to alternative nucleoside analogues following symptomatic hyperlactatemia and lactic acidosis. AIDS 2003; 17: 2495-2499.

Lonergan JT, Behling C, Pfander H, Hassanein TI, Mathews WC. Hyperlactatemia and hepatic abnormalities in 10 human immunodeficiency virus-infected patients receiving nucleoside analogue combination regimens. Clin Infect Dis 2000; 31: 162-166.

Mallon PW, Unemori P, Sedwell R et al. In vivo, nucleoside reverse-transcriptase inhibitors alter expression of both mitochondrial and lipid metabolism genes in the absence of depletion of mitochondrial DNA. J Infect Dis 2005; 191: 1686-1696.

Martin A, Smith DE, Carr A et al. Reversibility of lipoatrophy in HIV-infected patients 2 years after switching from a thymidine analogue to abacavir: the MITOX Extension Study. AIDS 2004; 18: 1029-1036.

Maxson CJ, Greenfield SM, Turner JL. Acute pancreatitis as a common complication of 2’,3’-dideoxyinosine therapy in the acquired immunodeficiency syndrome. Am J Gastroenterol 1992; 87: 708-713.

McComsey GA, O’Riordan M, Setzer B, Lebrecht D, Baron E, Walker UA. Uridine supplementation in HIV lipoatrophy: pilot trial on safety and effect on mitochondrial indices. Eur J Clin Nutr 2008; 62: 1031-1037.

McComsey GA, Paulsen DM, Lonergan JT et al. Improvements in lipoatrophy, mitochondrial DNA levels and fat apoptosis after replacing stavudine with abacavir or zidovudine. AIDS 2005; 19: 15-23.

McComsey GA, Ward DJ, Hessenthaler SM et al. Improvement in lipoatrophy associated with highly active antiretroviral therapy in human immunodeficiency virus-infected patients switched from stavudine to abacavir or zidovudine: the results of the TARHEEL study. Clin Infect Dis 2004; 38: 263-270.

McComsey GA, Yau L. Asymptomatic hyperlactataemia: predictive value, natural history and correlates. Antivir Ther 2004; 9: 205-212.

McKee EE, Bentley AT, Hatch M, Gingerich J, Susan-Resiga D. Phosphorylation of thymidine and AZT in heart mitochondria: elucidation of a novel mechanism of AZT cardiotoxicity. Cardiovasc Toxicol 2004; 4: 155-167.

Miro O, Lopez S, Pedrol E et al. Mitochondrial DNA depletion and respiratory chain enzyme deficiencies are present in peripheral blood mononuclear cells of HIV-infected patients with HAART-related lipodystrophy. Antivir Ther 2003; 8: 333-338.

Moyle G, Lysakova L, Brown S et al. A randomized open-label study of immediate versus delayed polylactic acid injections for the cosmetic management of facial lipoatrophy in persons with HIV infection. HIV Med 2004; 5: 82-87.

Moyle GJ, Sadler M. Peripheral neuropathy with nucleoside antiretrovirals: risk factors, incidence and management. Drug Safety 1998; 19: 481-494.

Negredo E, Moltó J, Burger D et al. Unexpected CD4 cell count decline in patients receiving didanosine and tenofovir-based regimens despite undetectable viral load. AIDS 2004; : 459-463.

Noguera A, Fortuny C, Sanchez E et al. Hyperlactatemia in human immunodeficiency virus-infected children receiving antiretroviral treatment. Pediatr Infect Dis J 2003; 22: 778-782.

Parsonage MJ, Wilkins EG, Snowden N, Issa BG, Savage MW. The development of hypophosphataemic osteomalacia with myopathy in two patients with HIV infection receiving tenofovir therapy. HIV Med 2005; 6: 341-346.

Ray AS, Olson L, Fridland A. Role of purine nucleoside phosphorylase in interactions between 2’,3’-dideoxyinosine and allopurinol, ganciclovir, or tenofovir. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 1089-1095.

Saada A, Shaag A, Mandel H, Nevo Y, Eriksson S, Elpeleg O. Mutant mitochondrial thymidine kinase in mitochondrial DNA depletion myopathy. Nat Genet 2001; 29: 342-344.

Saint-Marc T, Touraine JL. The effects of discontinuing stavudine therapy on clinical and metabolic abnormalities in patients suffering from lipodystrophy. AIDS 1999; 13: 2188-2189.

Setzer B, Lebrecht D, Walker UA. Pyrimidine nucleoside depletion sensitizes to the mitochondrial hepatotoxicity of the reverse transcriptase inhibitor stavudine. Am J Pathol 2008; 172: 681-690.

Setzer B, Schlesier M, Thomas AK, Walker UA. Mitochondrial toxicity of nucleoside analogues in primary human lymphocytes. Antivir Ther 2005a; 10: 327-334.

Setzer B, Schlesier M, Walker UA. Effects of of didanosine-related depletion of mtDNA in human T lymphocytes. J Infect Dis 2005b; 191: 848-855.

Shiramizu B, Shikuma KM, Kamemoto L et al. Placenta and cord blood mitochondrial DNA toxicity in HIV-infected women receiving nucleoside reverse transcriptase inhibitors during pregnancy. J Acquir Immune Defic Syndr 2003; 32: 370-374.

Simpson DM, Tagliati M. Nucleoside analogue-associated peripheral neuropathy in human immunodeficiency virus infection. J Acquir Immune Defic Syndr 1995; 9: 153-161.

Sommadossi JP, Carlisle R, Schinazi RF, Zhou Z. Uridine reverses the toxicity of 3’-azido-3’-deoxythymidine in normal human granulocytemacrophage progenitor cells in vitro without impairment of antiretroviral activity. Antimicrob Agents Chemother 1988; 32: 997-1001.

Sutinen J, Walker UA, Sevastianova K et al. Uridine supplementation for the treatment of antiretroviral therapy-associated lipoatrophy: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Antivir Ther 2007; 12: 97-105.

Tardieu M, Brunelle F, Raybaud C et al. Cerebral MR imaging in uninfected children born to HIV-seropositive mothers and perinatally exposed to zidovudine. AJNR Am J Neuroradiol 2005; 26: 695-701.

Tenofovir review team. Memorandum. www fda gov 2001.

294

van Groeningen CJ, Leyva A, Kraal I, Peters GJ, Pinedo HM. Clinical and pharmacokinetic studies of prolonged administration of high-dose uridine intended for rescue from 5-FU toxicity. Cancer Treatment Reports 1986; 70: 745-750.

Venhoff N, Setzer B, Lebrecht D, Walker UA. Dietary supplements in the treatment of NRTI-related mitochondrial toxicity. AIDS 2002; 16: 800-802.

Venhoff N, Walker UA. Mitochondrial disease in the offspring as a result of antiretroviral therapy. Expert Opin Drug Saf 2006; 5: 373-381. Venhoff N, Zilly M, Lebrecht D et al. Uridine pharmacokinetics of Mitocnol, a sugar cane extract. AIDS 2005; 19: 739-740.

Walker UA, Auclair M, Lebrecht D, Kornprobst M, Capeau J, Caron M. Uridine abrogates the adverse effects of antiretroviral pyrimidine analogues on adipose cell functions. Antivir Ther 2006a; 11: 25-34.

Walker UA, Bickel M, Lütke Volksbeck SI et al. Evidence of nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitor-associated genetic and structural defects of mitochondria in adipose tissue of HIV-infected patients. J Acquir Immune Defic Syndr 2002a; 29: 117-121.

Walker UA, Byrne E. The therapy of respiratory chain encephalomyopathy: a critical review of the past and current perspective. Acta Neurol Scand 1995; 92: 273-280.

Walker UA, Hoffmann C, Enters M, Thoden J, Behrens G, Mitzel SL. High serum urate in HIV-infected persons: the choice of the antiretroviral drug matters. AIDS 2006b; 20: 1556-1558.

Walker UA, Langmann P, Miehle N, Zilly M, Klinker H, Petschner F. Beneficial effects of oral uridine in mitochondrial toxicity. AIDS 2004; 18: 1085-1086.

Walker UA, Setzer B, Venhoff N. Increased long-term mitochondrial toxicity in combinations of nucleoside analogue reverse-transcriptase inhibitors. AIDS 2002b; 16: 2165-2173.

Walker UA, Venhoff N, Koch E, Olschweski M, Schneider J, Setzer B. Uridine abrogates mitochondrial toxicity related to nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors in HepG2 cells. Antivir Ther 2003; 8: 463-470.

Wanner DP, Tyndall A, Walker UA. Tenofovir induced osteomalacia. Clin Exp Rheumatol 2009 in press.

2 9. Токсическое действие НИОТ на митохондрии

295

2 Антиретровирусная терапия

10. Определение резистентности ВИЧ

Патрик Браун, Ева Вольф

Появление резистентных (устойчивых) штаммов ВИЧ — одна из главных причин неэффективности антиретровирусной терапии. Если возникает устойчивость к препаратам сразу нескольких групп, возможности выбора препаратов для следующей схемы терапии значительно сокращаются. Однако сейчас появилась возможность назначать эффективные резервные схемы терапии, включающие ИП или ННИОТ второго поколения, у которых другие профили резистентности, или препараты новых групп, например, ингибиторы проникновения или ингибиторы интегразы. При заменах терапии по причине развития резистентности бывает полезным восстановление чувствительности вируса к препаратам (ресенсибилизация).

Быстрое появление резистентных штаммов ВИЧ обусловлено высокой скоростью репликации ВИЧ — ежедневно образуется почти 10 млн новых вирусных частиц (Perelson, 1996) — а также очень большой частотой ошибок репликации, совершаемых обратной транскриптазой ВИЧ. Это приводит к высокой частоте появления мутаций и постоянному образованию новых штаммов вируса даже в отсутствие лечения. На фоне приема антиретровирусных препаратов происходит селективный отбор резистентных штаммов, и они начинают преобладать в общей популяции вируса (Drake, 1993).

В этой главе при обсуждении генотипической резистентности вируса рассказывается большей частью о мутациях резистентности и их сочетаниях (так называемых «профилях резистентности»), возникающих в генах, кодирующих обратную транскриптазу, протеазу, интегразу и белки наружной оболочки, на фоне селективного воздействия антиретровирусных препаратов. Дается общее представление о правилах интерпретации результатов генотипирования. Большинство данных получено на основании обследования пациентов с вирусами подтипа В (которые в структуре глобальной эпидемии ВИЧ-1-инфекции составляют лишь приблизительно 10%). Однако вирусы не-В-подтипов тоже изучались. У разных подтипов вируса механизмы развития резистентности и профили резистентности могут отличаться (Snoeck, 2006).

Методы определения резистентности вируса

Для оценки устойчивости (или чувствительности) ВИЧ к отдельным антиретровирусным препаратам существует два основных метода — фенотипирование и генотипирование (Wilson, 2003).

Системы для генотипирования, одобренные FDA:

§HIV-1 TruGene™ (Siemens Healthcare Diagnostics)

§ViroSeq™/ABI Prism® 3100 Genetic Analyzer (Abbott Molecular/Applera Corporation of Applied Biosystems and Celera)

Другие системы для генотипирования, например, GeneSeq™ (Monogram Biosciences), разрабатываются в лабораториях компаний-производителей и применяются в клинических исследованиях.

Стандартные методы генотипирования (основанные на изучении популяции вируса в целом) выявляют мутантные штаммы, составляющие не менее 20% от общей популяции вируса. В некоторых лабораториях применяются сверхчувствительные методы (аллелеспецифичная ПЦР в реальном времени, секвенирование отдельных геномов), которые выявляют мутантные штаммы, составляющие <0,1–5% от общей популяции вируса. Клиническое значение «минорных» штаммов пока не установлено.

Системы для фенотипирования включают:

§Antivirogram™ (Virco)

§PhenoSense™ (Monogram Biosciences)

§Phenoscript™ (Viralliance)

Кнедостаткам фенотипирования следует отнести большие затраты времени на проведение исследования и высокую стоимость. Стоимость исследования колеблется в зависимости от лаборатории и используемой системы и составляет от 350 до 450 евро для генотипирования и примерно вдвое больше для фенотипирования. .

296

Применение обоих методов ограничивается требованиями к минимальному уровню виремии: уровень вирусной нагрузки менее 500–1000 копий/мл зачастую недостаточен для определения резистентности вируса.

Фенотипирование

При фенотипировании получают количественную оценку непосредственной чувствительности вируса к антиретровирусным препаратам. При этом сравнивают скорость репликации выделенных от пациента штаммов ВИЧ в клеточной культуре в присутствии разных концентраций антиретровирусных препаратов со скоростью репликации штамма дикого типа (контрольного штамма) в присутствии тех же концентраций антиретровирусных препаратов.

Для каждого препарата определяют показатель IC50 (концентрацию препарата, которая подавляет репликацию вируса в клеточной культуре на 50%). Затем для определения чувствительности вируса вычисляют отношение IC50 для исследуемого штамма к IC50 для контрольного штамма (дикого типа) и сравнивают полученную величину (коэффициент резистентности) с пороговой. Если полученная величина меньше пороговой, штамм считают чувствительным, если больше — устойчивым. Пороговая величина показывает, во сколько раз IC50 для исследуемого штамма может превышать IC50 для дикого штамма, чтобы вирус все еще считался чувствительным к препарату. Поэтому определение пороговых величин очень важно для интерпретации результатов.

На сегодняшний день таких пороговых величин три.

Техническая пороговая величина учитывает вариабельность получаемых результатов, обусловленную методологическими особенностями проведения исследования.

Биологическая пороговая величина отражает вариабельность штаммов дикого типа, выделяемых от разных пациентов, ранее не получавших АРТ. Если IC50 для исследуемого штамма ниже биологической пороговой величины, вероятность вирусологического эффекта очень высока. Однако если IC50 превышает биологическую пороговую величину, то предсказать эффективность препарата невозможно.

И наоборот, клиническая пороговая величина указывает на уровни IC50, при которых подавление репликации вируса еще возможно .

В бланках результатов фенотипирования, проведенных с помощью систем vircoType™ и PhenoSense, указываются нижняя и верхняя клинические пороговые величины. Нижняя клиническая пороговая величина соответствует коэффициенту резистентности (изменению IC50), который свидетельствует о незначительном снижении чувствительности вируса к препарату. Если коэффициент резистентности превышает верхнюю клиническую пороговую величину, то вирус считается резистентным к препарату. Если коэффициент резистентности находится в диапазоне клинической чувствительности, то это говорит о частичном снижении чувствительности вируса к препарату (или о частичной резистентности). Вследствие ограниченного клинического опыта диапазоны клинической чувствительности для недавно одобренных к применению препаратов не установлены.

Генотипирование

При генотипировании выявляют известные мутации, вызывающие резистентность вируса. Для этого применяются методы прямого секвенирования амплифицированного генома ВИЧ, а также методы гибридизации с олигонуклеотидами дикого или мутантного штамма вируса. Важные сведения, которые могут повлиять на решения относительно дальнейшего лечения, получают при секвенировании гена pol, кодирующего вирусные ферменты протеазу, обратную транскриптазу и интегразу, а также при секвенировании гена env, кодирующего гликопротеины наружной оболочки вируса, gp41 и gp120.

Интерпретация результатов генотипирования (сочетания выявленных мутаций резистентности) основывается на корреляции генотипа, фенотипа и клинической эффективности. Данные о такой корреляции получают из исследований in vitro, клинических исследований, клинических наблюдений и так называемых «двойных» исследований, когда штаммы с известными (выявленными генотипическим методом) мутациями проверяют на фенотипическую резистентность.

297

2 10. Определение резистентности ВИЧ

2 Антиретровирусная терапия

Системы для интерпретации результатов генотипирования, основанные на закономерностях

Для фенотипической интерпретации выявленных сочетаний мутаций резистентности широко используются системы для интерпретации (алгоритмы), основанные на закономерностях. Экспертные группы (например, HIV-GRADE) разработали алгоритмы, основанные на опубликованных данных и данных клинических наблюдений.

§HIV-GRADE, http://www.hiv-grade.de

§Stanford Database, http://hivdb.stanford.edu/pages/asi/

§The Rega Algorithms, http://www.rega.kuleuven.be/cev/index.php?id=30

Системы для интерпретации результатов генотипирования, основанные на математической обработке баз данных, и виртуальное фенотипирование

Вотличие от разработанных экспертами алгоритмов интерпретации, основанных на накопленном опыте (knowledge-based), в системах для интерпретации, основанных на математической обработке баз данных (data-based), таких, как geno2pheno или vircoType™, используются математические алгоритмы для определения «виртуального» фенотипа исходя из результатов генотипирования. При виртуальном фенотипировании вся информация о фенотипе вируса основывается на сведениях о его генотипе, при этом реально фенотипирование не проводится. Предположительное описание фенотипических свойств вируса получают на основании обработки больших баз данных, в которых содержится информация о генотипах и соответствующих им фенотипических свойствах штаммов вирусов.

Вбесплатной системе для интерпретации geno2pheno используются технологии искусственного интеллекта, в том числе построение дерева решений и поддерживающие векторные машины (Beerenwinkel, 2003).

Система для интерпретации vircoType™ основана на модели множественной линейной регрессии с использованием базы данных, содержащей информацию о нескольких десятках тысяч генотипов и соответствующих им фенотипических свойствах. Для каждого препарата коэффициент резистентности определяется с учетом всех обнаруженных у данного штамма вируса известных мутаций резистентности к этому препарату. При этом учитываются известные синергические и антагонистические эффекты определенных пар мутаций, которые включены в математическую модель. Отдельным мутациям или парам мутаций присваиваются весовые коэффициенты (по отношению к определенному препарату), в зависимости от величины их влияния на резистентность вируса. Весовые коэффициенты положительны для отдельных мутаций или пар мутаций, которые усиливают резистентность вируса, и отрицательны для мутаций или пар мутаций, которые восстанавливают чувствительность вируса к препарату.

Основные положения и система обозначений

Каждой аминокислоте в структуре вирусных белков соответствует группа из трех нуклеотидов (кодон или триплет) в нуклеотидной последовательности генома ВИЧ. В обозначение каждой точечной мутации резистентности входит порядковый номер кодона (что позволяет определить расположение мутации в пределах гена) и две буквы. Перед порядковым номером ставится буква, соответствующая кодируемой данным кодоном аминокислоте у дикого штамма вируса. Буква после порядкового номера соответствует аминокислоте, кодируемой мутантным кодоном. Например, M184V — это мутация в кодоне 184 гена обратной транскриптазы, в результате которой в структуре фермента обратной транскриптазы произошла замена метионина (как у дикого штамма вируса) на валин.

Механизмы резистентности

НИОТ — это пролекарства, которые превращаются в биологически активные метаболиты только после внутриклеточного превращения в трифосфат. Для нуклеотидных аналогов требуется только два этапа фосфорилирования, а не три, как для нуклеозидных аналогов. Фосфорилированные НИОТ конкурируют с природными дезоксирибонуклеозидтрифосфатами. Встраивание фосфорилированного НИОТ в провирусную ДНК обрывает ее дальнейший синтез.

Установлено два основных биохимических механизма формирования резистентности к НИОТ (De Mendoza, 2002). Стерическое ингибирование обеспечивается мутациями, которые изменяют

298

структуру активного центра обратной транскриптазы таким образом, что она начинает отличать НИОТ от природных нуклеозидов; в результате вероятность встраивания НИОТ в провирусную ДНК резко снижается. Стерическое ингибирование наблюдается при мутациях M184V, Q151M, L74V и K65R (Naeger, 2001; Clavel, 2004).

Фосфоролиз НИОТ с участием АТФ (аденозинтрифосфата) или пирофосфата приводит к отсоединению уже встроенного НИОТ от растущей провирусной цепи ДНК. Этот механизм обеспечивается мутациями M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y и K219Q (Meyer, 2000). Фосфоролиз приводит к появлению перекрестной резистентности к НИОТ, при этом наблюдается следующая закономерность в уровнях резистентности к конкретным НИОТ: AZT, d4T > ABC > ddI > 3TC. В отличие от мутаций «отсоединения», мутация K65R приводит к уменьшению вероятности отсоединения всех НИОТ (по сравнению с вирусом дикого типа), увеличивая стабильность их соединения с ДНК. Комбинированный эффект мутации K65R (двух противоположных механизмов — уменьшения вероятности присоединения и уменьшения вероятности отсоединения) приводит к снижению чувствительности вируса ко всем НИОТ, за исключением зидовудина, к которому чувствительность даже повышается (White, 2005).

ННИОТ также ингибируют вирусный фермент обратную транскриптазу (ОТ). ННИОТ — маленькие молекулы, которые связываются с гидрофобным карманом, расположенным рядом с каталитическим доменом обратной транскриптазы. Мутации участка гена, кодирующего участок связывания ННИОТ, снижают способность ННИОТ связываться с ОТ, что приводит к утрате их антиретровирусного действия. Перекрестную резистентность к ННИОТ первого поколения способна вызвать одна точечная мутация, однако ННИОТ второго поколения обладают более сложными профилями резистентности.

ИП препятствуют расщеплению протеазой вирусного полипротеина Gag-Pol (предшественника вирусных белков) и тем самым приводят к образованию незрелых вирусных частиц, не способных инфицировать другие клетки. Устойчивость к ингибиторам протеазы обычно развивается медленно, поскольку для приобретения существенного уровня резистентности штамм вируса должен накопить несколько мутаций резистентности (т. е. преодолеть так называемый генетический барьер). Мутации резистентности к ингибиторам протеазы подразделяют на основные (первичные, большие) и второстепенные (вторичные, малые) мутации.

Таблица 10.1. Мутации резистентности к ингибиторам протеазы

Основные мутации

D30N, V32I, M46I/L/V, I47V/A, G48V/M, I50V/L, I54VM/L/T/A/S, L76V, V82A/T/F/T/L/S/M/C, I84V/A/C, N88D/S/T/G, L90M

Второстепенные мутации

L10IVFRY, V11I, I13V, K20MRTIVI, L24I, L33F/I, E35G, K43T, F53L/Y, Q58E, A71V/T/I, G73C/A/T/S, T74P, N83D, L89V

(HIV Drug Resistance Database (База данных по мутациям резистентности ВИЧ к лекарственным препаратам), Sequence Analyses Program (Программа анализа последовательностей), версия 5.0.0, 4 ноября 2008 г.; http://hivdb.stanford.edu/pages/asi/releaseNotes/updates.html)

Основные мутации обеспечивают фенотипическую резистентность. Они начинают закрепляться первыми на фоне селективного действия антиретровирусного препарата. Эти мутации изменяют активный центр фермента-мишени (протеазы ВИЧ), уменьшая способность ингибитора протеазы к связыванию с этим ферментом. Основные мутации могут также приводить к снижению активности протеазы. Второстепенные мутации не затрагивают активный центр фермента и обычно появляются позже основных. Второстепенные мутации часто обнаруживаются в полиморфных участках вирусов не-В-подтипа Второстепенные мутации компенсируют снижение жизнеспособности вируса, вызванное основными мутациями (Nijhuis, 1999; Johnson, 2007b). Мутации в кодонах 20, 36, 63, и 77 представляют собой полиморфизмы, которые обнаруживаются также у вирусов, не подвергавшихся селективному действию ИП, в особенности у вирусов не-В-подтипа. Их вклад в резистентные свойства вируса невелик и зависит от присутствия других мутаций.

Ингибиторы слияния препятствуют проникновению ВИЧ в клетки-мишени. На первом этапе проникновения в клетку гликопротеин наружной оболочки вируса gp120 связывается с рецептором CD4 и хемокиновыми корецепторами (CCR5 или CXCR4) клетки-мишени. Взаимодействие между двумя участками гептадных повторов HR1 и HR2 трансмембранного гликопро-

299

2 10. Определение резистентности ВИЧ