Вопрос №16 «схема лабораторной диагностики вирусных инфекций».

Лабораторная диагностика – это система мер по обнаружению, индикации вируса. В нее входят: получение посланного патологического материла, исследование патологического материала методом быстрой диагностики, исследование длительными методами (ретроспективная диагностика, исследование парных сывороток в серореакциях).

Лабораторные исследования. I.Индикация вируса в патологическом материале. 1.Обнаружение – световая микроскопия крупных вирусов (Poxviridae), электронная микроскопия. 2.Обнаружение телец-включений. (тельца Бабеша-Шенегри при бешенстве) 3.Обнаружение вирусных антигенов: серологические реакции. 4.Обнаружение вирусных НК (ДНК-зонды и ПЦР – полимеразно-цепная реакция). 5.Обнаружение активной формы вируса путем биопробы (лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток). 6.Обнаружение гемаглютининов у гемаглютинирующих вирусов (в настоящее время практически не используется по причине наличия более точных методов). II.Изоляция (выделение) вируса из патологического материала. Проводится не менее трех слепых пассажей, делается биопроба. А)Лабораторные животные (клиника, гибель, пат. изменения) Б)Куриные эмбрионы (гибель, пат. изменения, РГА) В)Культура клеток (ЦПД, РГАд, метод бляшек) III.Идентификация выделенного вируса – серологические реакции. IV.Доказательство этиологической роли. Иногда требуется доказать этиологическую роль выделенного вируса. Для этого используют парные сыворотки крови в серологических реакциях. В качестве АГ используют выделенный вирус, а в качестве АТ – парные сыворотки. Повышение титра антител во второй сыворотке в 4 и более раз свидетельствует о этиологической роли выделенного вируса.

Вопрос №17 «клинико-эпизоотологическая диагностика вирусных болезней животных, сущность, значение».

Клинико-эпизоотологическая или до-лабораторная диагностика – проводится в хозяйствах и позволяет поставить лишь предварительный диагноз, проводится распознавание на основе сбора, сопоставления анализа о больных животных (клинические симптомы болезни, Патологоанатомические изменения в органах). Сбор эпизоотологических данных очень важен, позволяет получить данные о том, как протекает заболевание, сведения о хозяйствах. Если хозяйства неблагополучны, то это лишний раз подтверждает диагноз. Клинический осмотр ориентирует ветеринара только на несколько видов болезней. Основное значение все же у лабораторной диагностики.

Вопрос №18 «методы обнаружения вируса в патматериале».

I.Индикация вируса в патологическом материале. 1.Обнаружение – световая микроскопия крупных вирусов (Poxviridae), электронная микроскопия. 2.Обнаружение телец-включений (тельца Бабеша-Шенегри при бешенстве) 3.Обнаружение вирусных антигенов: серологические реакции. 4.Обнаружение вирусных НК (ДНК-зонды и ПЦР – полимеразно-цепная реакция). 5.Обнаружение активной формы вируса путем биопробы (лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток). 6.Обнаружение гемаглютининов у гемаглютинирующих вирусов (в настоящее время практически не используется по причине наличия более точных методов). Для идентификация выделенного вируса – серологические реакции. 1.РИФ – реакция иммунофлюорисценции. АГ + АТ меченные флюорохромом. Дают контакт 30 минут при 37 С, затем производят тщательный отмыв в ИХН. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом. 2.ИФА – иммуно-ферментный анализ. АГ + АТ с ферментом. Контакт, отмыв, затем добавляют субстрат, который при контакте с АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию. 3.РСК – реакция связывания комплемента. АГ + АТ + комплемент. Контакт. Затем добавляют гем-систему (гемолизин + эритроциты барана). Контакт. Если гемолиза не происходит, значит АГ и АТ связали комплемент. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная. 4.РДП - реакция диффузной преципитиции. АГ + АТ (диффузия в агаровом геле). Метод обнаружения – образование контура преципитации. 5.РНГА – реакция непрямой гемаглютинации. Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов. 6.РТГА – реакция торможения гамаглютинации 7.РТГАд – реакция торможения гемадсорбции 8.РН – реакция нейтрализации. Вирус + АТ. Контакт. Ввод в чувствительную к вирусу систему. Метод обнаружения – нейтрализация инфекционной активности вируса.

ВОПРОС №19 «ПРИНЦИП РЕТРОСПЕКТИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ, ПЛЮСЫ И МИНУСЫ ЕЕ».

Ретроспективная диагностика – преследует цель обнаружить динамику прироста АТ, основана на исследовании парных сывороток, которые берут дважды, в начале болезни и в конце. Их проверяют в одной из серореакций. Если прирост АТ в 4-5 раз больше – 100% постановка диагноза.

+ роль – метод позволяет достоверно поставить диагноз в большинстве случаев.

- роль – длительность ретроспективной диагностики.

ВОПРОС №20 «ВИРУС БОЛЕЗНИ АУЕСКИ».

Болезнь Ауески (псевдобешенство, зудящая чума, бешеная чесотка, инфекционный бульбарный паралич) – остро протекающая болезнь всех видов сельскохозяйственных животных, пушных зверей и грызунов. Характеризуется признаками поражения головного и спинного мозга, сильным зудом и расчесами.

Особый ущерб БА приносит в свиноводстве и пушном звероводстве. У пушных зверей это острая кормовая инфекция. Причиной является пища, которой нередко служат боенские отходы и субпродукты, полученные от больных животных или животных вирусоносителей.

Клиника. Инкубационный период – 1,5 суток – 10-12 дней в зависимости от метода заражения, вирулентности вируса и устойчивости животного. Вирус пантропен.

У свиней клиника протекает без признаков зуда. Тяжело болеют сосуны и отъемыши. Болезнь носит септический характер. Поросята обычно погибают через 4-12 часов. У поросят от 10 дней до 3-х месяцев первые признаки болезни – лихорадка (40-42), угнетение, слизистые истечения из носа. Позднее появляются признаки поражения ЦНС: беспокойство, манежные движения, потеря ориентации, судороги, прогиб спины, параличи глотки, гортани, конечностей, отек легких, слюнотечение. Болезнь длится от нескольких часов до 3-х дней. Летальность: 70-100%

У свиноматок проявляется в виде гриппоподобного синдрома с выздоровлением через 3-4 дня.

У КРС повышается температура до 42 С, прекращается жвачка, сильный зуд в областе ноздрей, губ, щек, отказ от корма, вялость, беспокойство, страх, учащенное дыхание, потливость, судороги жевательных и шейных мышц. Смерть наступает при нарастающей вялости через 1-2 суток. Выздоровления крайне редки.

У плотоядных животных наблюдается отказ от корма, пугливость, беспокойство, сильный зуд. Иногда у собак и кошек проявляются признаки бешенства. Потом наступает паралич глотки. Смерть через 2-3 суток. Животные не являются источником вируса и не выделяют его, являясь экологическим тупиком.

Заподозрить болезнь Ауески можно по характерным клиническим симптомам и патологоанатомическим изменениям (клинико-эпизоотологическая и патологоанатомическая диагностика).

Материал для исследования: смывы из носовой полости и кровь (лучше парные сыворотки), от трупов - кусочки головного мозга, легких, печени, селезенки.

Экспресс-метод - обнаружение вирусного антигена в РИФ. Вирусологический метод: а) выделение вируса на культуре клеток почек поросят: б) биопроба на кроликах (характерны зуд и расчесы в месте заражения).

Идентификация: РИФ, РН.

Ретроспективная диагностика: по приросту титра антител в парных выворотках.

Следует дифференцировать болезнь Ауески от бешенства, чумы свиней, гриппа, рожи, отравления поваренной солью.

Применятся живая вирусвакцина ВГНКИ, инактивированная культурная вакцина – иммунитет на 6-10 месяцев.За рубежом используются субъединичные и рекомбинантные вакцины.

ВОПРОС №21 «ЗНАЧЕНИЕ И ОСОБЕННОСТИ ВИРУСНЫХ БЕЛКОВ».

Смотри вопрос №7

ВОПРОС №22 «ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ».

В целях определения вида данного вируса при изучении защитных процессов в организме больного человека или зараженного животного применяются серологические методы. Серология (от лат. Serum - сыворотка, жидкая составная часть крови) - это раздел иммунологии, изучающий реакции антигена специфическими защитными веществами, антителами, которые находятся в сыворотке крови. Антитела нейтрализуют действие вируса. Они связываются с определенными антигенными веществами, находящимися на поверхности вирусных частиц. В результате связывания молекул антител с поверхностной структурой вируса последний теряет свои патогенные свойства. Для установления уровня (количества) антител в сыворотке или определения типа данного вируса проводится реакция нейтрализации вируса. Ее можно проводить как на животных, так и на культуре клеток.

Минимальную концентрацию сыворотки, содержащей антитела, достаточную для того, чтобы нейтрализовать вирус, не дать ему проявить ЦПД, называют титром сыворотки, нейтрализующей вирус. Эта концентрация может быть выявлена и с помощью метода бляшек.

Для обнаружения антител используется метод торможения гемагглютинации (склеивания эритроцитов под воздействием вируса) и метод связывания комплемента. Из методов, применяемых в вирусологии для различных исследовательских целей, можно еще упомянуть методы, при помощи которых вирусологический материал подготавливается для физических и химических анализов, которые облегчают изучение тонкого строения и состава вирусов. Эти анализы требуют большого количества совершенно чистого вируса. Очистка вируса - процесс, при котором из суспензии с вирусом устраняются все посторонние, загрязняющие ее частицы. В основном это кусочки и «обломки» клеток - хозяев. Одновременно с очисткой происходит обычно сгущение суспензии, повышение концентрации вируса. Так получается исходный материал для многих исследований.

С помощью серологической реакции можно: определять титр АТ к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень АГ родства 2 вирусов, определять титр вируснейтрализующих АТ в сыворотке, или индекс нейтрализации, идентифицировать неизвестный вирус путем испытания его с различными заведомо известными сыворотками.

Серологические реакции.

1. РИФ – реакция иммунофлюорисценции.

АГ + АТ меченные флюорохромом. Дают контакт 30 минут при 37 С, затем производят тщательный отмыв в физрастворе. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом.

2. ИФА – иммуно-ферментный анализ.

АГ + АТ с ферментом. Контакт, отмыв, затем добавляют субстрат, который при контакте с АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию.

3. РСК – реакция связывания комплемента.

АГ + АТ + комплемент. Контакт. Затем добавляют гем-систему (гемолизин + эритроциты барана). Контакт. Если гемолиза не происходит, значит АГ и АТ связали комплемент. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная.

4. РДП - реакция диффузной преципитиции.

АГ + АТ (диффузия в агаровом геле). Метод обнаружения – образование контура преципитации.

5. РНГА – реакция непрямой гемаглютинации.

Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов.

6. РТГА – реакция торможения гамаглютинации

7. РТГАд – реакция торможения гемадсорбции

8. РН – реакция нейтрализации.

Вирус + АТ. Контакт. Ввод в чувствительную к вирусу систему. Метод обнаружения – нейтрализация инфекционной активности вируса.