Вопрос №23, 25 «ртга и ее использование в вирусологии. Достоинства и недостатки».

Одной из простейших серологических реакции является реакция торможения гемаглютинации. Она основана на том, что АТ при встрече с гомологичным АГ нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, т.к. блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс «АГ+АТ». Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия АТ сыворотки и вируса. РТГА позволяет решать следующие задачи: определять титр АТ к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень АГ родства двух вирусов. Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток РТГА: возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Принцип титрования АТ в РТГА состоит в следующем: готовят ряд последовательных (обычно 2-х кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаще по 0,25 или 0,2 мл); к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ; смеси выдерживают определенное время при определенной температуре, ко всем смесям добавляют равные объемы 1-% суспензии отмытых эритроцитов; после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах.

Вопрос №26 «рдп. Иммунологическая основа меода, постановка и учет результатов. Достоинства и недостатки».

РДП в геле основана на способности к диффузии в гелях АТ и растворимых АГ и отсутствие такой способности у комплекса «АГ+АТ». Этот комплекс образуется при контакте диффундирующих навстречу друг другу гомологичных АГ и АТ. Он осаждается на месте образования в толще геля в виде полосы преципитации. В качестве геля используют крахмал, желатин, агар-агар и другое. В лабораторной практике очень часто используют агаровый гель. АТ сыворотки представляют собой молекулы Ig, которые, несмотря на довольно крупные размеры. Способны диффундировать в агаровом геле. АГ вирусов – это вирусные белки. Они могут находится в составе вирионов, представляя так называемые корпускулярные АГ. Крупные размеры которые не позволяют им диффундировать в агаровом геле. Но белки вирусов могут быть и в виде свободных молекул, образующихся в результате деструкции вирионов и (или) разрушения клеток, в которых они образовались. Это растворимые АГ. Они способны к диффузии в агаровом геле. Методика постановки РДП в геле состоит в том, что в слое агарового геля делают несколько углублении и в них наливают АГ и сыворотки так. Чтобы АГ и сыворотка были в соседних лунках. Из лунок АГ и сыворотки начинают диффундировать в слой геля. Диффузия направлена во все стороны от каждой лунки. В пространстве между лунками, содержащими АГ и сыворотку, последние диффундируют навстречу друг другу. Если они окажутся гомологичными, то образуется комплекс «АГ+АТ», который к диффузии не способен вследствие более крупных размеров. Он оседает на месте образования в виде беловатой полосы преципитации. РДП решает задачи: 1) обнаружение в сыворотке крови АТ, гомологичных АГ; 2) обнаружение в материале АГ, гомологичного известным АТ сыворотки;3) идентификация неизвестного вируса; 4) титрование АТ сыворотки. Здесь высшее разведение сыворотки, еще дающее преципитацию с гомологичным АГ, служит показателем титра АТ в сыворотке. РДП часто используют для диагностики лейкоза КРС и инфекционной анемии лошадей. Реакция м\б поставлена в чашках Петри, на предметных стеклах, капиллярах (редко). Для осуществления РДП на предметных стеклах нужны: обезжиренные предметные стекла, градуированные пипетки (2-5 мл), пастеровские пипетки; трубка диаметром 5мм или штамп, влажная камера, инструмент для извлечения из лунок геля, агар, АГ, сыворотки. Постановка РДП: Предметные стекла кладут на холодную поверхность. Из пипетки наливают агар (слой 1,5-2 мм), дают остыть 5-10 минут. Вырезают лунки, запаивают их. В лунки заливают компоненты РДП, помещают во влажную камеру (где оставляют при комнатной температуре или ставят в термостат). Препарат РДП на предметных стеклах можно через 48-72 часа высушить и окрасить раствором амидного черного. Это позволяет сохранить препарат неопределенно долго и улучшает возможность фотографировать полосы преципитации. Плюсы РДП: простота техники постановки, быстрота получения ответа, нетребовательность к чистоте компонентов, не требуется стерильной работы, минимальная потребность в компонентах, пригодность для работы с любыми растворимыми АГ, возможность документирования результата путем фотографирования. Минусы РДП: низкая чувствительность. Реакцию ставят для обнаружения в патматериале вирусов бешенства, инфекционного ринотрахеита КРС, африканской чумы свиней, чумы собак, других; А также для идентификации вирусов инфекционной анемии лошадей, аденовирусов, респираторно-синцитиального вируса, вируса диареи КРС, для обнаружения в сыворотках крови АТ к вирусам инфекционной анемии лошадей, респираторно-синцитиального вируса КРС и во многих других случаях.