Volume1

228 Часть 1. Введение в мир клетки

Рис. 3.33. Три механизма, предопределяющих размер крупных белковых ансамблей. а) Совместная сборка на вытянутом стержневом кор-белке (или иной макромолекуле), который выступает в роли дозатора. б) Завершение сборки из-за напряжения, которое накапливается в полимерной структуре по меревключения в нее дополнительных субъединиц, так что по достижении некоторойустановленной длины энергия, необходимая для присоединения следующей субъединицы к цепи, становится чрезмерно большой. в) Сборка по механизму Вернье, когда две группы стержнеобразных молекул, отличающихсяподлине,формируютвнутреннесмещенныйкомплекс,которыйрастетдотехпор,пока концыэтихмолекулвточностинесовместятсядругсдругом.Этоназваниепроисходитотизмерительного устройства(верньера,илинониуса),основанногонатомжепринципеиприменяемоговмеханических измерительныхинструментах.

Даже относительно простым структурам может недоставать некоторых компонентов, необходимых для их сборки. Например, при образовании некоторых бактериальных вирусов головка, которая состоит из множества копий одной белковой субъединицы, собирается на временном каркасе, состоящем из другого белка. Поскольку второй белок отсутствует в конечной вирусной частице, головка не может самопроизвольно собраться вновь, если была разрушена. Известны и другие примеры, в которых протеолитическое расщепление является существенным и необ-

ратимым шагом в естественном процессе сборки. Это относится даже к некоторым малым белковым сборках, в том числе к структурному белку коллагену и гормону инсулину (рис. 3.35). Из этих относительно простых примеров становится очевидно, что сборка такой сложной структуры, как например, митохондрия или ресничка, предполагает временнóе и пространственное упорядочение, сообщаемое ей множеством других компонентов клетки.

Рис. 3.34. Электронный микрофотоснимок бактериофага λ.

Кончик хвоста вируса прикрепляется к специфическому белку наповерхностибактериальнойклетки,послечегоплотноупакованнаявегоголовкеДНКвводитсячерезхвоствклетку.Хвост имеетточнозаданнуюдлину,определяемуюмеханизмом,показаннымнарис.3.33,а.

Глава 3. Белки 229

Рис. 3.35. Протеолитическое расщепление при сборке инсулина. Полипептидный гормон инсулин не может самопроизвольно осуществлять эффективную повторную сборку после разрушения его ди­ сульфидных связей. Он синтезируется в виде крупного белка (проинсулина), который расщепляется протеолитическимферментом,послетогокакбелковаяцепьсвернетсяиприметспецифическуюформу. При вырезании части полипептидной цепи проинсулина удаляется и часть информации, необходимая длясамопроизвольногосворачиваниябелкавегоестественнуюконформацию.Кактолькоинсулинбудет денатурирован, его две полипептидные цепи отделятся одна от другой и способность к повторной сборкебудетутрачена.

Заключение

Пространственная конформация молекулы белка определяется ее аминокис- лотной последовательностью. Свернутая структура стабилизируется некова- лентными взаимодействиями между различными частями полипептидной цепи. Аминокислоты с гидрофобными боковыми цепями тяготеют к образованию кла- стеров внутри молекулы, а локальные взаимодействия на основе водородных связей между соседними пептидными связями дают начало α-спиралям и β-листам.

230 Часть 1. Введение в мир клетки

Глобулярные области, известные под названием домены, служат модуль- ными единицами, из которых строятся многие белки; такие домены обычно содержат 40–350 аминокислот. Малые белки, как правило, состоят только из одного-единственного домена, тогда как крупные белки образованы из не- скольких доменов, соединенных друг с другом участками полипептидной цепи различной длины, при этом некоторые из таких областей могут быть отно- сительно неупорядочены. В ходе эволюции белков домены видоизменялись и поновому сочетались с другими доменами, в результате чего появлялись новые белки. К настоящему времени известно приблизительно 800 различных способов укладки доменов для более 20 000 известных белковых структур.

Белки объединяются в крупные структуры с помощью таких же некова- лентных взаимодействий, что и те, которые определяют сворачивание белка. Белки с участками связывания, настроенными на их собственную поверх- ность, могут собираться в димеры, замкнутые кольца, сферические оболочки или спиралеобразные полимеры. Хотя, как было показано, в пробирке смеси белков и нуклеиновых кислот способны самопроизвольно собираться в сложные структуры, многие биологические процессы сборки включают необратимые со- бытия. В силу этого не все клеточные структуры способны самопроизвольно воссоединяться после разделения их на составные части.

3.2.  Функция белка

Как мы могли убедиться, белок каждого определенного типа состоит из точно заданной последовательности аминокислот, которая позволяет ему сворачиваться в специфическую трехмерную структуру, или конформацию. Но белки отнюдь не являются жесткими кусками материала. Чаще всего они имеют искусно сработанные подвижные органы, механические действия которых сопряжены с химическими процессами. Именно эта взаимосвязь — химии и движения – придает белкам их необыкновенные способности, которые лежат в основе динамических процессов, протекающих в живых клетках.

В данном параграфе мы объясняем механизм избирательного связывания белков с другими молекулами и разъясняем, как активность первых зависит от связывания с последними. Мы показываем, что способность связываться с другими молекулами позволяет белкам выполнять функции катализаторов, сигнальных рецепторов, переключателей, двигателей или крошечных насосов. Примеры, которые мы разбираем в этой главе, ни в коем случае не исчерпывают обширный функциональный репертуар белков. Внимательный читатель не упустит из вида множества упоминаний о специализированных функциях многих других белков, основанных на подобных принципах.

3.2.1.  Всем белкам предначертана связь с другими молекулами

Биологические свойства любой молекулы белка определяются ее взаимодействием с другими молекулами. Так, антитела прикрепляются к вирусам или бактериям

итем самым «метят» их для разрушения; фермент гексокиназа связывает глюкозу

иATP, чтобы катализировать реакции между ними; молекулы актина связываются друг с другом и собираются тем самым в актиновые филаменты, и тому подобное. И в самом деле, все белки слипаются, или связываются, с другими молекулами. В одних случаях такое связывание очень прочное, в других оно слабое и недолговеч-

Глава 3. Белки 231

ное. Но взаимодействия подобного рода всегда отличает высокая специфичность — в том смысле, что обычно молекула белка может связать только одну или несколько молекул из многих тысяч различных видов молекул, с которыми она сталкивается. Вещество, которое связано белком, — будь оно ионом, какой-либо маленькой молекулой или макромолекулой, скажем, другого белка, — является лигандом этого белка (от латинского слова ligare, означающего, «связываться»).

Способность белка связывать лиганд избирательно и с высокой степенью сродства определяется набором группы слабых нековалентных связей: водородных связей, электростатических взаимодействий и ван-дер-ваальсовых сил, — а также благоприятных гидрофобных взаимодействий (см. приложение 2.3, стр. 176–177). Поскольку каждая отдельная связь слаба, эффективное связывание возникает только тогда, когда одновременно образуется большое число таких связей. Такое связывание возможно только в том случае, если контуры поверхности молекулы лиганда полностью соответствуют поверхности белковой молекулы, в результате чего они настолько хорошо прилегают одна к другой, как выбранная по размеру перчатка к руке (рис. 3.36).

Рис. 3.36. Избирательное связывание белка с другой молекулой. Чтобы белок мог прочно связаться с другой молекулой, которая служит для него лигандом, необходимо образование большого числа слабых связей. Поэтому лиганд должен точно вписываться в участок связывания белка, как, скажем, рука входит в перчатку, с тем чтобы между белком и лигандом могло образоваться большое число нековалентныхсвязей.

Область белка, которая непосредственно соединяется с лигандом, известна в научных кругах под названием участка связывания (сайта связывания) лиганда и обычно состоит из углубления в поверхности белка, образуемого за счет специфического расположения аминокислот. Эти аминокислоты могут принадлежать к разным частям полипептидной цепи, которые сблизились друг с другом в результате фолдинга белка (рис. 3.37). На разнесенных друг от друга областях белковой поверхности, как правило, формируются участки связывания разных лигандов, что позволяет регулировать активность белка, как мы увидим чуть позже. Остальные части белка, можно сказать, играют роль манипулятора, необходимого для надлежащего размещения белка в клетке, — примером служит уже рассматривавшийся нами домен SH2, который во многих случаях в ответ на специфические сигналы перемещает белок, его содержащий, в определенные области внутри клетки.

232 Часть 1. Введение в мир клетки

Рис.3.37.Участоксвязываниябелковоймолекулы.а)Вре-

зультатефолдингаполипептиднойцепиобычнообразуется бороздка,или углубление, на поверхности белка. Такая бороздка содержит группу аминокислот, боковые цепи которых расположены таким образом, что могут образовывать нековалентные связи лишь с определенными лигандами. б)Крупныйпланреальногоучасткасвязывания,накотором показаныводородныесвязииэлектростатическиевзаимодействиямеждубелкомиеголигандом.Вданномпримере связанныйлигандпредставленциклическимAMP(cAMP).

Глава 3. Белки 233

Хотя атомы, находящиеся во внутренних областях белковой молекулы, не имеют прямого контакта с лигандом, они формируют каркас, который придает поверхности ее очертания и обусловливает ее химические и механические свойства. Даже небольшие изменения аминокислот во внутренних областях белковой молекулы способны изменить ее пространственную структуру достаточно сильно – вплоть до разрушения участка связывания.

3.2.2.  Химия белка определяется его поверхностной конформацией

Белки обладают удивительными химическими свойствами, потому что соседствующие химические группы на их поверхности часто взаимодействуют таким образом, что химическая активность боковых цепей аминокислот возрастает. Такого рода взаимодействия можно подразделить на две основные категории.

Во-первых, взаимодействие соседних частей полипептидной цепи может ограничить доступ молекул воды к участкам связывания лиганда этого белка. Это важно, потому что молекулы воды легко образуют водородные связи и могут конкурировать с лигандами за участки на поверхности белка. Белки и их лиганды формируют более прочные водородные связи (и электростатические взаимодействия), если молекул воды нет на участках связывания. Возможно, не так просто представить себе механизм, который исключал бы связывание с поверхностью белка столь малой молекулы, как молекула воды, и не препятствовал бы при этом доступу самого лиганда к этой поверхности. Тем не менее из-за сильного стремления молекул воды к образованию водородных связей друг с другом эти молекулы существуют

ввиде протяженной сети, стянутой водородными связями (см. приложение 2.2, стр. 174–175). Благодаря этому белок может сохранять лиганд-связывающий сайт «сухим», потому что в энергетическом отношении процесс отрыва молекул воды от водной сети – а именно это им пришлось бы совершить, чтобы проникнуть

вбороздку на поверхности белка, – не является благопрятным.

Во-вторых, определенное группирование соседних полярных боковых цепей аминокислот может изменить их реакционную способность. Например, если в результате фолдинга в одной из областей белка сосредоточивается ряд аминокислот с отрицательно заряженными боковыми цепями, то, несмотря на их взаимное отталкивание, сродство такого участка к положительно заряженному иону многократно усиливается. Кроме того, когда боковые цепи аминокислот взаимодействуют друг с другом через водородные связи, обыкновенно неактивные боковые группы (такие как –CH2OH серина, показанного на рис. 3.38) могут стать реакционно-способными, что позволяет им участвовать в образовании или разрушении определенных ковалентных связей.

Поэтому поверхность любой белковой молекулы обладает неповторимой совокупностью химических свойств, которая зависит не только от того, боковые цепи каких аминокислот смотрят наружу, но также и от их точной взаимной ориентации. По этой причине две даже слегка отличающиеся конформации одной и той же белковой молекулы могут разительно отличаться по химическим свойствам.

3.2.3.  Ключевые участки связывания лигандов можно выявить при сравнении аминокислотных последовательностей белков, входящих в одно семейство

Как было сказано ранее, последовательности генома позволяют нам группировать многие белковые домены по семействам, в пределах которых явно прослежи-

234 Часть 1. Введение в мир клетки

Рис.3.38.Аминокислота,проявляющаянеобычайновысокуюреакционнуюспособностьвактивном участке фермента. Данный пример относится к так называемой «каталитической триаде», свойственной химотрипсину, эластазе и другим сериновым протеазам (см. рис. 3.12). Боковая цепь аспарагиновой кислоты (Asp 102) возбуждает гистидин (His 57), который забирает протон у серина (Ser 195). Эти действия активируют серин, получающий способность образовать ковалентную связь с субстратом фермента, гидролизуя при этом пептидную связь. На рисунке не показаны многочисленные изгибы полипептиднойцепи.

вается их эволюция от общего предка. Трехмерные структуры членов одного и того же семейства доменов поразительно похожи. Например, даже когда идентичность аминокислотных последовательностей снижается до 25 %, укладка атомов в остове полипептидной цепи домена подчиняется общей закономерности в пределах 0,2 нанометров (2 Å).

Поэтому для идентификации в белковом домене тех участков, которые наиболее значимы для функции этого домена, мы можем использовать метод «эволюционного следа» (evolutionary tracing). Для этой цели на модель трехмерной структуры одного из членов семейства наносят те аминокислоты, которые остались неизменившимися (инвариантными) или почти неизменившимися во всех известных членах этого семейства белков. В результате, наиболее инвариантные позиции, как правило, образуют один или несколько кластеров на поверхности белка, что можно видеть на рис. 3.39, а, где изображен домен SH2, описанный ранее (см. приложение 3.2, стр. 200–201). Эти кластеры обычно и соответствуют участкам связывания лигандов.

Домен SH2 служит модулем, который участвует в межбелковых взаимодействиях. Он связывает белок, его содержащий, со следующим белком, который содержит боковую цепь фосфорилированного тирозина в окружении определенной аминокислотной последовательности, как показано на рис. 3.39, б. Аминокислоты, расположенные на участке связывания фосфорилированных полипептидов, как оказалось, изменялись медленнее всего в течение длительного эволюционного процесса, который дал многочисленное семейство пептид-узнающих SH2-доменов.

Глава 3. Белки 235

Рис. 3.39. Применение метода эволюционного следа к домену SH2. а) Вид спереди и сзади на объ-

емной модели домена SH2, где эволюционно консервативные аминокислоты на поверхности белка окрашены желтым, а ближе к сердцевине белка — красным. б) Структура домена SH2 со связанным им полипептидом. Здесь аминокислоты, расположенные в пределах 0,4 нм от связанного лиганда, окрашены голубым. Две ключевые аминокислоты лиганда желтые, а все остальные — фиолетовые. Обратитевниманиенавысокуюстепеньсоответствиямеждуструктурами,изображенныминавидаха и б. (Переработано на основе иллюстраций из O. Lichtarge, H. R. Bourne and F. E. Cohen, J. Mol. Biol. 257:

342–358,1996.СлюбезногоразрешенияиздательстваElsevier.)

Поскольку мутация – случайное событие, этот результат приписывают предпочтительному устранению в ходе эволюции всех тех организмов, у которых домены SH2 изменялись таким образом, что пептид-связывающий участок терял активность, и, таким образом, нарушалась сама функция SH2-домена.

В нашу эру интенсивного секвенирования геномов открыто много новых семейств белков, функции которых неизвестны. Как только удается определить трехмерную структуру одного из членов семейства, метод «эволюционного следа» позволяет биологам определить участки связывания у остальных членов этого семейства, помогая тем самым расшифровать функции этих белков.

3.2.4.  Одни белки связываются с другими белками через контактные поверхности нескольких типов

Белки способны связываться с другими белками по крайней мере тремя способами. Во многих случаях часть поверхности одного белка («замок») входит в контакт с распростертой петлей полипептидной цепи («ключ») на втором белке (рис. 3.40, а). Такое взаимодействие типа ключ–замок позволяет, например, домену SH2 опознавать фосфорилированную полипептидную петлю второго белка, как только что было описано, или протеинкиназе — белки, которые ей предстоит фосфорилировать (смотрите ниже).

Межбелковое соединение второго типа образуется, когда две α-спирали, по одной от каждого белка, спариваются одна с другой с образованием витой суперспирали (рис. 3.40, б). Межбелковый стык такого типа встречается в нескольких семействах ген-регулирующих белков, о чем мы расскажем в главе 7.

Наиболее распространенным способом контактного взаимодействия белков, однако, является точное соответствие одной жесткой поверхности другой (рис. 3.40, в). Такое взаимодействие может быть достаточно сильным, так как между двумя точно пригнанными одна к другой поверхностями может образоваться большое число

236 Часть 1. Введение в мир клетки

Рис. 3.40. Три возможных способа, которыми два белка могут связываться друг с другом. Показаны только взаимодействующие части двух таких белков. а) Жесткая поверхность одного белка может связаться с развернутой петлей полипептидной цепи («нити») второго белка. б) Две α-спирали могут связатьсядругсдругомпутемобразованиявитойбиспирали.в)Двевзаимнодополняющиедругдруга (комплементарные)жесткиеповерхностичастоудерживаютдвабелкавместе.

слабых связей. По той же причине такие межповерхностные взаимодействия могут быть чрезвычайно специфичными, что позволяет белку выбирать лишь одного партнера из многих тысяч различных белков клетки.

3.2.5.  Особым многообразием отличаются участки связывания антител

Для того чтобы выполнять разнообразные функции, каждый белок должен связываться с определенным лигандом. Семейство антител примечательно тем, что все его члены обладают способностью к сильному избирательному связыванию (рассматривается подробно в главе 25).

Антитела, или иммуноглобулины, представляют собой белки, производимые иммунной системой в ответ на появление чужеродных молекул, например, тех, что находятся на поверхности вторгшегося микроорганизма. Каждое антитело прочно связывается с определенной целевой молекулой, тем самым или инактивируя ее напрямую, или помечая для разрушения. Всякое антитело распознает свою мишень (называемую антигеном) с удивительной специфичностью. Поскольку возможно существование миллиардов различных антигенов, с которыми люди сталкиваются в жизни, наш организм должен быть готов произвести миллиарды различных антител.

Антитела представляют собой Y-образные молекулы с двумя идентичными участками связывания, которые комплементарны небольшой части поверхности молекулы антигена. Подробный анализ участков связывания антигенов на антителах показывает, что они сформированы несколькими петлями полипептидной цепи, которые выступают по концам пары близко совмещенных белковых доменов (рис. 3.41). Огромное многообразие участков связывания антигенов различными антителами обусловлено всего лишь изменениями длины и аминокислотной последовательности этих петель, без изменения основной структуры белка.

Петли такого рода идеальны для того, чтобы захватывать другие молекулы. Они позволяют окружать лиганд большим числом химических групп, с тем чтобы белок мог связаться с ним посредством многочисленных слабых связей. По этой причине лиганд-связывающие участки белков часто формируются именно из петель.

Глава 3. Белки 237

Рис.3.41.Молекулаантитела.а)ТипичнаямолекулаантителаимеетY-образнуюформусдвумяидентич- нымиучасткамисвязываниясвоегоантигена–поодномунакаждомплечеY-образнойструктуры.Этот белок состоит из четырех полипептидных цепей (двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных

именьших легких цепей), скрепленных вместе дисульфидными связями. Каждая цепь состоит из несколькихразличныхдоменовиммуноглобулина,помещенныхнаданномрисункенаголубойилисерый фон. Антиген-связывающий участок образуется в том месте, где вариабельный (изменчивый) домен тяжелойцепи(VH) ивариабельныйдоменлегкойцепи(VL)сближеныдругсдругом.Последовательности

иструктуры именно этих доменов отличаются в различных антителах. Каждый из доменов на концах плечмолекулыантителаобразуетпетли,которыесвязываютсясантигеном.Навидебмыможемвидеть этиподобныепальцампетли(красные),выдающиесяиздоменаVL.

3.2.6.  Мерой силы связывания служит константа равновесия

Молекулы в клетке очень часто наталкиваются друг на друга из-за непрерывного беспорядочного теплового движения. Сталкивающиеся молекулы, поверхности которых «не вписываются» друг в друга, образуют между собой небольшое число нековалентных связей и расходятся столь же скоро, сколь быстро они сошлись. Другая крайность — когда между двумя сталкивающимися молекулами образуется много нековалентных связей и их союз может существовать довольно длительное время (рис. 3.42). Сильные взаимодействия в клетках возникают всякий раз, когда биологическая функция требует, чтобы молекулы оставались взаимосвязанными в течение продолжительного промежутка времени, например, когда группа молекул РНК и молекул белка собирается воедино с образованием субклеточной структуры наподобие рибосомы.

Мы можем измерить силу, с которой любые две молекулы связываются друг с другом. В качестве примера рассмотрим популяцию идентичных молекул антител, которая внезапно сталкивается с популяцией лигандов, диффундирующих в окружающей антитела жидкости. При этом с определенной частотой одна из молекул