Volume1

258 Часть 1. Введение в мир клетки

«иной», и стерео, означающего «пространственный», или «трехмерный»). Когда биологи больше узнали о регуляции по типу обратной связи, они признали, что вовлеченные в такого рода регуляцию ферменты должны иметь по крайней мере два разных участка связывания на своей поверхности — активный участок, который распознает субстраты, и регуляторный участок, который опознает регуляторную молекулу. Эти два участка должны каким-то образом сообщаться между собой, с тем чтобы каталитические события на активном участке так или иначе зависели от связывания регуляторной молекулы на предназначенном для нее отдельном участке на поверхности белка.

Взаимодействие между разобщенными участками на молекуле белка, как теперь известно, зависит от конформационного изменения в белке: связывание на одном из участков вызывает переход из одной свернутой формы в другую, немного отличную. В процессе ингибирования по типу обратной связи, например, связывание ингибитора на одном участке белка побуждает белок перейти в конформацию, которая выводит из строя его активный участок, расположенный в ином месте белковой молекулы.

Считается, что в большинстве своем белковые молекулы являются аллостерическими. Они способны принимать две и более слегка разнящиеся конформации, и переход из одной в другую, вызванный связыванием лиганда, может изменить их активность. Это верно не только для ферментов, но также и для многих других белков, в том числе рецепторов, структурных белков и моторных белков. Во всех случаях аллостерической регуляции каждая из конформаций белка характеризуется несколько отличающимися очертаниями поверхности, так что присущие белку участки связывания лигандов изменяются, когда белок изменяет форму. Более того, о чем мы еще скажем позже, каждый лиганд стабилизирует ту конформацию, в которой его связывание наиболее сильно, и, таким образом, — при достаточно высоких концентрациях — будет стремиться «переключить» белок в ту конформацию, которую предпочитает.

3.2.17.  Два лиганда, участки связывания которых сопряжены, оказывают взаимное влияние на связывание с этим ферментом

Воздействие связывания лиганда на белок проистекает из фундаментального химического принципа, известного как взаимосвязь, или сопряжение. Предположим, например, что некоторый белок, который связывает глюкозу, связывает также и другую молекулу X на участке, расположенном на каком-то расстоянии от глюкозосвязывающего. Если участок связывания молекулы X изменяет свою форму как часть конформационного изменения, вызванного связыванием глюкозы, то участки связывания молекул X и глюкозы, как говорят, сопряжены. Как следует из основных начал термодинамики, если два лиганда предпочтительно связываются с одной и той же конформацией аллостерического белка, то каждый из этих лигандов должен увеличивать сродство данного белка ко второму лиганду. Таким образом, если переход белка на рис. 3.58 в замкнутую конформацию, которая связывает глюкозу наилучшим образом, обусловливает также и лучшее соответствие Х-участка связывания молекулам X, то при наличии молекул Х такой белок будет связывать глюкозу сильнее, чем в их отсутствие.

И наоборот, механизм сцепления развивается по негативному сценарию, если два лиганда предпочитают связываться с различными конформациями одного

Глава 3. Белки 259

Рис. 3.58. Положительная регуляция, обусловленная конформационным сопряжением между двумяразнесеннымивпространствеучасткамисвязывания.В данном примереиглюкоза,имолекула X

связываютсялучшевсегосзамкнутойконформациейнекоторогобелка,состоящегоиздвухдоменов. Посколькуиглюкоза,имолекулаXпобуждаютбелокпринятьзамкнутуюконформацию,каждыйизлигандовспособствуетсвязываниюдругого.ГлюкозаимолекулаX,какговорят,кооперативносвязываются сбелком.

итого же белка. В таком случае связывание первого лиганда препятствует связыванию второго лиганда. Таким образом, если изменение конформации, вызванное связыванием глюкозы, уменьшает сродство белка к молекуле X, то связывание молекулы X будет тоже снижать сродство белка к глюкозе (рис. 3.59). В количественном отношении действие двух сопряженных лигандов тоже взаимосвязано, так что, например, если глюкоза оказывает очень сильное влияние на связывание вещества X, то вещество X очень сильно влияет на связывание глюкозы.

Зависимости, представленные на рис. 3.58 и 3.59, относятся ко всем белкам,

илежат в основе всей клеточной биологии. В ретроспективе, в которой мы теперь воспринимаем их как нечто само собой разумеющееся, они кажутся вполне очевидными. Но открытие сопряжения в ходе изучения нескольких ферментов в 1950-х гг., за которым последовал всесторонний анализ аллостерических механизмов в белках в начале 1960-х, произвело революционный эффект в нашем понимании биологии. Поскольку молекула X в этих примерах связывается с ферментом на некотором участке, который отделен от участка, где происходит катализ, она может быть представлена любым веществом и не «состоять в родственной связи» – в химическом отношении – с глюкозой или любым другим лигандом, который связывается с этим ферментом в активном участке. Более того, как мы только что убедились, для ферментов, которые регулируются подобным образом, молекула X может либо «включать» фермент (положительная регуляция), либо «выключать» его (отрицательная регуляция). Благодаря такому механизму аллостерические белки служат главными переключателями, которые,

в принципе, позволяют какой-либо одной молекуле в клетке влиять на метаболическое будущее другой молекулы.

260 Часть 1. Введение в мир клетки

Рис.3.59.Отрицательнаярегуляция,обусловленнаяконформационнымсопряжениеммеждудвумя разнесеннымивпространствеучасткамисвязывания.Представленнаяздесьсхеманапоминаеттако-

вую на предыдущем рисунке, но здесь молекула X предпочитает открытую конформацию, тогда как глюкоза отдает предпочтение замкнутой конформации. Поскольку глюкоза и молекула X побуждают белок принять противоположные конформации (соответственно замкнутую и открытую), присутствие какого-либоизлигандовмешаетсвязываниюдругого.

3.2.18.  Симметричные белковые комплексы создают кооперативные аллостерические переходы

Односубъединичный фермент, который регулируется отрицательной обратной связью, в ответ на 100-кратное увеличение концентрации ингибирующего лиганда,

скоторым он связывается, может самое большее снизить активность с 90 % до приблизительно 10 (рис. 3.60, красная линия). Вполне очевидно, что отклика такого уровня недостаточно для оптимального управления клеткой, и большинство ферментов, которые включаются или отключаются посредством связывания лиганда, образовано симметричными комплексами, состоящими из идентичных субъединиц. При таковой организации связывание молекулы лиганда на единственном участке одной субъединицы может обусловить аллостерическое изменение во всей сборке, которое помогает соседним субъединицам связывать тот же лиганд. В результате происходит кооперативный аллостерический переход (рис. 3.60, синяя линия),

позволяющий при относительно малом изменении концентрации лиганда в клетке переводить весь ансамбль белков из почти полностью активной конформации в почти полностью неактивную форму (или наоборот).

Принципы, лежащие в основе кооперативного перехода (осуществляющегося по правилу «все или ничего»), одинаковы для всех белков, будь то ферменты или нет. Но эти принципы, возможно, легче всего наглядно продемонстрировать на примере фермента, который образует симметричный димер. В примере, показанном на рис. 3.61, первая молекула ингибирующего лиганда связывается

сбольшим трудом, так как ее связывание нарушает энергетически благоприятное взаимодействие между двумя идентичными мономерами в димере. Однако после

Глава 3. Белки 261

Рис. 3.60. Активность фермента в зависимости от концентрации ингибирующего лиганда: для ферментаизоднойсубъединицыимногосубъединичныхаллостерическихферментов.Вслучаефермента из одной-единственной субъединицы (красная линия) для снижения его ферментативной активности с 90 до 10 % (отмечены двумя точками на кривой) требуется увеличение концентрации ингибитора в 100 раз. Активность фермента вычисляется из простого отношения равновесия K=[IP]/[I] [P], где P — активный белок, I — ингибитор, а IP — неактивный белок, связанный с ингибитором. Такая же кривая будет отражать характер любого простого взаимодействия типа связывания между двумя молекулами: А и B. В противоположность первому, многосубъединичный аллостерический фермент может откликаться на изменение концентрации лиганда по типу «переключателя»: крутой участок кривой соответствует кооперативному связыванию молекул лиганда, которое поясняется на рис. 3.61. Здесь зеленаялинияпредставляетидеализированныйрезультат,ожидаемыйоткооперативногосвязывания двухингибирующихмолекуллигандасаллостерическимферментомиздвухсубъединиц,асиняялиния показывает идеализированный «отклик» для фермента из четырех субъединиц. Как отмечено двумя точками на каждой из кривых, для более сложных ферментов снижение активности с 90 до 10 % происходит в гораздо более узком диапазоне концентраций ингибитора, чем для фермента, состоящего изодной-единственнойсубъединицы.

этого вторая молекула ингибирующего лиганда связывается легче, потому что ее связывание восстанавливает энергетически благоприятные мономер-мономерные контакты в симметричном димере (в результате этих процессов фермент полностью инактивируется).

В качестве альтернативы такой модели кооперативного аллостерического перехода по типу индуцированного соответствия мы можем рассматривать такой симметричный фермент как имеющий только две возможные конформации, соответствующие структурам «фермент работает» и «фермент не работает», показанным на рис. 3.61. Согласно такому представлению, связывание лиганда возмущает равновесие типа «все или ничего» между этими двумя состояниями, таким образом изменяя долю активных молекул. Обе модели представляют истинную и удобную в использовании концепцию; вот эту вторую модель мы и опишем в очередном пункте.

3.2.19.  Аллостерический переход в аспартаттранскарбамоилазе изучен с точностью до отдельных атомов

Одним из ферментов, применявшихся в ранних исследованиях аллостерической регуляции, была аспартаттранскарбамоилаза, получаемая из E. coli.

262 Часть 1. Введение в мир клетки

Рис. 3.61. Кооперативный аллостерический переходвферменте,состоящемиздвухиден-

тичных субъединиц. На данной схеме показан механизм,посредствомкоторогоконформация одной субъединицы может влиять на конформациюсоседней.Связываниеодноймолекулы ингибирующего лиганда (желтого) с одной субъединицей фермента происходит с трудом, потомучтоприводиткизменениюконформации этой субъединицы и таким образом нарушает симметрию фермента. Однако, как только такое конформационное изменение произошло, выигрыш в энергии, получаемый при восстановлении симметричности спаривания между этими двумя субъединицами, обусловливает возможность особенно легкого связывания второй субъединицы ингибирующего лиганда с осуществлением того же конформационного перехода.Посколькусвязываниепервоймолекулылигандаувеличиваетсродство,скоторым другая субъединица связывает тот же лиганд, реакцияферментанаизменениеконцентрации этого лиганда намного более резкая, нежели отклик фермента, состоящего лишь из одной субъединицы(см.рис.3.60).

Она катализирует важную реакцию, с которой начинается синтез пиримидинового кольца нуклеотидов C, U и T: карбамоилфосфат + аспартат →

→ N карбамоиласпартат. Один из конечных продуктов этого пути, цитозинтрифосфат (CTP), связывается с ферментом, чтобы выключить его, всякий раз, когда концентрация CTP достигает определенного порога.

Аспартаттранскарбамоилаза представляет собой крупный комплекс из шести регуляторных и шести каталитических субъединиц. Каталитические субъединицы образуют два тримера, каждому из которых придана форма равностороннего треугольника; эти два тримера смотрят друг на друга и удерживаются в должном положении тремя регуляторными димерами, которые образуют своеобразный мост между ними. Вся молекула в целом подготовлена к осуществлению слаженного, отвечающего принципу «все или ничего» аллостерического перехода между двумя конформациями, обозначаемыми буквами T (напряженное) и R (ненапряженное) состояния (рис. 3.62).

Связывание субстратов (карбамоилфосфата и аспартата) с каталитическими тримерами переводит аспартаттранскарбамоилазу в каталитически активное состояние R, что сопровождается диссоциацией регуляторных молекул CTP. И наоборот, связывание CTP с регуляторными димерами переводит фермент в неактивное состояние T, и тогда происходит диссоциация субстрата. Такое «перетягивание каната» между CTP и субстратами по своему принципу тождественно описанному нами ранее «противоборству» на рис. 3.59 – на примере более простого аллосте-

Глава 3. Белки 263

Рис. 3.62. Переход между состояниями R и T в ферменте аспартаттранскарбамоилазе. Этот фермент представляетсобойкомплексизшестикаталитическихсубъединицишестирегуляторныхсубъединиц; структуры неактивной (состояние T) и активной (состояние R) форм этого фермента были определены спомощьюрентгеноструктурнойкристаллографии.Фермент«выключается»посредствомингибирования по типу обратной связи, когда концентрация CTP повышается. Каждая регуляторная субъединица можетсвязатьоднумолекулуCTP—одинизконечныхпродуктовпролегающегочерезданныйфермент метаболического пути. Посредством такой регуляции по типу отрицательной обратной связи этот путь огражденотпроизводствабóльшегоколичестваCTP,чемэтонеобходимоклетке.(Восновурисункапо-

ложенаиллюстрацияизK. L. Krause,K. W. VolzandW. N. Lipscomb,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82: 1643–1647, 1985.СлюбезногоразрешенияNationalAcademyofSciences.)

рического белка. Но поскольку подобного рода конкуренция развивается в симметричной молекуле с многочисленными участками связывания, фермент подвергается кооперативному аллостерическому переходу, который внезапно включает его при накоплении субстратов (переводя его в состояния R) или быстро отключает, если накопится большой объем CTP (переключая его в состояние T).

Благодаря сочетанию биохимии и рентгеновской кристаллографии удалось выявить множество захватывающих подробностей такого аллостерического перехода. Каждая из регуляторных субъединиц имеет два домена, и связывание CTP

264 Часть 1. Введение в мир клетки

вызывает смещение этих двух доменов друг относительно друга, так что они работают подобно рычагу, который поворачивает два каталитических тримера и подтягивает их ближе друг к другу в состоянии T (см. рис. 3.62). Когда это происходит, между противостоящими каталитическими субъединицами образуются водородные связи. Это помогает расширить углубление, которое образует активный участок в пределах каждой каталитической субъединицы, и таким образом разрушает участки связывания субстратов (рис. 3.63). Увеличение количества субстрата вызывает противоположный эффект — когда предпочтение отдается состоянию R, ибо происходит связывание субстрата в углублениях всех каталитических субъединиц, что противодействует вышеописанному конформационному изменению. Конформации, которые являются промежуточными между состояниями R и T,

Рис.3.63.Частьпереключателятипа«включено-выключено»вкаталитическихсубъединицахаспар-

таттранскарбамоилазы.Изменениявобозначенныхводородныхсвязяхотчастиответственнызапереключение активного участка этого фермента на активную (желтая) или неактивную конформацию. Водородные связи обозначены тонкими красными линиями. Аминокислоты, вовлеченные во взаимодействие субъединица–субъединица в состоянии T, показаны красным, тогда как те, что образуют активныйучастокферментавсостоянииR,показанысиним.Набольшихрисункахпоказанкаталитический участок изнутри; заключенные в рамку эскизы показывают те же субъединицы на внешней поверхно-

стифермента.(ПереработаноизE. R. KantrowitzandW. N. Lipscomb,TrendsBiochem.Sci.15:53–59,1990.

СлюбезногоразрешенияиздательстваElsevier.)

Глава 3. Белки 265

неустойчивы, так что фермент главным образом перескакивает туда-сюда между своими R- и T-формами, давая смесь этих двух разновидностей в соотношениях, которые зависят от относительных концентраций CTP и субстратов.

3.2.20.  Многие изменения в белках осуществляются за счет фосфорилирования

Белки регулируются отнюдь не только обратимым связыванием с какими-либо другими молекулами. Второй способ, к которому эукариотические клетки прибегают для регулирования функций белков, — ковалентное присоединение более мелкой молекулы к одной или нескольким боковым цепям аминокислот белка. Наиболее обычной формой такой регуляторной модификации у высших эукариот является присоединение фосфатной группы. Поэтому мы используем фосфорилирование белка для иллюстрации некоторых общих принципов, лежащих в основе управления функцией белка путем модификации боковых цепей аминокислот.

Событие фосфорилирования может воздействовать на модифицируемый белок по двум важным путям. Во-первых, поскольку каждая фосфатная группа несет два отрицательных заряда, то катализируемое ферментом присоединение фосфатной группы к белку может вызвать значительное конформационное изменение в этом белке за счет, например, притяжения группы положительно заряженных боковых цепей аминокислот. Это может, в свою очередь, повлиять на связывание лигандов и тем самым заметно изменить активность фосфорилированного белка по сравнению с исходным. Когда второй фермент удаляет фосфатную группу, белок возвращается в исходную конформацию и восстанавливает первоначальную активность.

Во-вторых, присоединенная фосфатная группа может образовать часть структуры, которую опознают участки связывания других белков. Как было сказано ранее, некоторые белковые домены, иногда называемые модулями, довольно часто входят в состав более крупных белков. Одним из таких модулей является домен SH2, описанный ранее, который связывается с короткой пептидной последовательностью, содержащей фосфорилированную боковую цепь тирозина (см. рис. 3.39, б). Более десяти других весьма распространенных доменов служат участками связывания для прикрепления несущего их белка к фосфорилированным пептидам, входящим в состав других белковых молекул, при этом каждый из этих доменов распознает фосфорилированную боковую цепь аминокислоты лишь в определенном пептидном контексте. В результате фосфорилирование и дефосфорилирование белка очень часто выступают движущей силой регулируемой сборки и разборки белковых комплексов (см. рис. 15.22).

В клетках эукариот обратимое фосфорилирование белка обеспечивает управление активностью, структурой и размещением в клетке как ферментов, так и белков многих других типов. Фактически, такая регуляция настолько всеобъемлюща, что более трети из 10 000 или около того белков в типичной клетке млекопитающих, как думают, подвергается фосфорилированию в любой момент времени — и многие более чем одним фосфатом. Как можно ожидать, добавление фосфатных групп к определенным белкам и «отъятие» первых от последних часто происходит в ответ на сигналы, определяющие некоторое изменение в состоянии клетки. Например, сложная череда событий, которая имеет место во время деления эукариотической клетки, в значительной степени хронометрируется именно таким способом (будет раскрыто в главе 17) и многие сигналы, опосредующие межклеточные взаимодействия, передаются с плазматической мембраны к ядру при помощи каскада событий фосфорилирования белка (рассмотрим в главе 15).

266 Часть 1. Введение в мир клетки

3.2.21.  Все эукариотические клетки содержат богатый набор протеинкиназ и протеинфосфатаз

Процесс фосфорилирования белка включает в себя катализируемый ферментом перенос конечной фосфатной группы молекулы ATP на гидроксильную группу боковой цепи серина, треонина или тирозина в молекуле этого белка (рис. 3.64). Эта реакция катализируется протеинкиназой и является в высшей степени однонаправленной из-за высвобождения большого количества свободной энергии при разрыве межфосфатной связи в ATP с последующим образованием ADP (о чем говорилось в главе 2). Протеинфосфатаза катализирует обратную реакцию – удаление фосфата, или дефосфорилирование. Клетки содержат сотни различных протеинкиназ, каждая из которых отвечает за фосфорилирование своего белка или набора белков. Имеется в них также множество различных протеинфосфатаз; некоторые из них крайне специфичны и удаляют фосфатные группы только с одного или с нескольких белков, тогда как другие работают с широким диапазоном белков и нацеливаются на определенные субстраты своими регуляторными субъединицами.

Рис.3.64.Фосфорилированиебелка.Втипичнойэукариотическойклеткемногиетысячибелковмодифицируютсяпутемковалентногоприсоединенияфосфатнойгруппы.а)Приведеннаяздесьобщаясхема реакциидаетпредставлениеотом,какспомощьюпротеинкиназыфосфатнаягруппаATPпереносится на боковую цепь аминокислоты целевого белка. Удаление фосфатной группы катализируется вторым ферментом — протеинфосфатазой. В данном примере фосфат модифицирует боковую цепь серина; вдругихслучаяхфосфат,вместоэтого,присоединяетсяпогруппе–ОНтреонинаилитирозинацелевого белка. б) Фосфорилирование белка протеинкиназой может либо увеличивать, либо уменьшать актив- ностьбелка—взависимостиотучасткафосфорилированияиструктурыэтогобелка.

Глава 3. Белки 267

Состояние фосфорилирования белка в любой момент времени, и тем самым его активность, зависит от относительной активности протеинкиназ и протеинфосфатаз, которые его модифицируют.

Протеинкиназы, которые фосфорилируют белки в ядерных клетках, принадлежат к очень большому семейству ферментов, которые имеют общую каталитическую (киназную) последовательность из приблизительно 290 аминокислот. Разные члены семейства содержат различные последовательности аминокислот на обоих концах киназной последовательности (например, см. рис. 3.10) и часто имеют короткие последовательности аминокислот, вставленные в петли внутри нее (красные стрелки на рис. 3.65). Некоторые из таких дополнительных аминокислотных последовательностей позволяют каждой киназе распознавать определенный набор белков, ею фосфорилируемый, или связываться со структурами, которые удерживают ее

вопределенных областях клетки. Другие составные части этого белкового фермента регулируют активность данной киназы, так что она может быть «включена» и «выключена» в ответ на различные специальные сигналы, как будет описано ниже.

На основании сравнений числа различий в аминокислотной последовательности разных членов семейства белков можно построить «эволюционное дерево», которое, как думают, отражает схему событий дупликации и дивергенции генов, которые и повлекли за собой развитие семейства. На рис. 3.66 изображено эволюционное дерево протеинкиназ. Киназы с близкими функциями часто расположены на близлежащих ветвях дерева: например, все протеинкиназы, участвующие в передаче сигналов

вклетке, завершающейся фосфорилированием боковых цепей тирозина, группируются

вверхнем левом углу дерева. Другие представленные здесь киназы фосфорилируют боковые цепи серина либо треонина, а многие организованы в группы, которые, кажется, отражают их функцию — трансмембранную передачу сигналов, усиление внутриклеточных сигналов, управление клеточным циклом и так далее.

Врезультате совместных действий

протеинкиназ и протеинфосфатаз фос-

Рис.3.65.Трехмернаяструктурапротеинкиназы.

Нанесенные на эту структуру красные стрелки указывают участки, в которых у некоторых членовсемействапротеинкиназбылиобнаружены вставкиразмером5–100аминокислот.Этивстав- ки расположены в находящихся на поверхности ферментапетлях,гдедругиелигандывзаимодействуютсэтимбелком.Такимобразом,онислужат отличительными признаками различных киназ и обусловливают характерные для них взаимодействия с другими белками. ATP (который отдает фосфатную группу) и пептид, подлежащий фосфорилированию, удерживаются в активном участке,которыйпростираетсямеждусвязывающей фосфат петлей (желтой) и каталитической петлей (оранжевой). См. также рис. 3.10. (Пере-

работано на основе D. R. Knighton et al., Science

253: 407–414, 1991. С любезного разрешения издательстваAAAS.)