Volume1

248 Часть 1. Введение в мир клетки

Когда же полисахарид связывается с лизоцимом, положение дел изменяется коренным образом. Активный участок лизоцима (по той причине, что его субстратом служит полимер) представляет собой длинную бороздку, в которой одновременно удерживается шесть последовательно связанных друг с другом сахаров. Как только полисахарид связывается с образованием фермент-субстратного комплекса, фермент разрезает полисахарид, присоединяя молекулу воды по одной из межуглеводных связей. После этого образовавшиеся олигосахариды быстро высвобождаются, тем самым освобождая фермент для выполнения следующих циклов (рис. 3.50).

Химия связывания лизоцима со своим субстратом та же, что и для антитела со своим антигеном, — образование многочисленных нековалентных связей. Однако лизоцим удерживает полисахаридный субстрат особым образом — так, что он искажает один из двух сахаров, образующих подлежащую уничтожению связь, относительно его нормальной, наиболее устойчивой конформации. Кроме того, эта связь, которая будет разрушена, удерживается вблизи двух находящихся в активном участке лизоцима аминокислот с кислыми боковыми цепями (глутаминовая и аспарагиновая кислоты).

Таким образом, в микросреде активного участка лизоцима создаются условия, которые сильно уменьшают энергию активации, необходимую для гидролиза. На рис. 3.51 представлены три основных этапа этой ферментативно катализируемой реакции.

Рис.3.50.Реакция,катализируемаялизоцимом.

а)Ферментлизоцим(E)катализируетразрезание полисахариднойцепи,котораяявляетсяегосубстратом (S). Этот фермент сначала связывается с цепью с образованием фермент-субстратного комплекса(E–S)изатемкатализируетрасщепле- ниеопределеннойковалентнойсвязивосновной цепиполисахарида,образуякомплексфермент– продукт (E–P), который быстро диссоциирует. Высвобождение расчлененной цепи (продукты P) освобождает фермент для дальнейшей работы — со следующей молекулой субстрата. б)Пространственнаямодельмолекулылизоцима, связанного с короткой цепью полисахарида перед ее расщеплением. (Изображение б любезнопредоставилR. J. Feldmann.)

Глава 3. Белки 249

Рис. 3.51. События в активном участке лизоцима. На верхнем левом и верхнем правом рисунках показанысоответственносвободныйсубстратисвободныепродукты,тогдакакдругиетририсункапоказываютпоследовательностьсобытий,происходящихвактивномцентрефермента.Обратитевнимание на изменение конформации сахара D в фермент-субстратном комплексе; такое изменение формы стабилизируетпереходныесостояния,подобныеионуоксокарбония,чтонеобходимодляобразования

игидролизаковалентногопромежуточногопродукта,показанногонасреднемрисунке.Такжевозможно, что на этапе 2 в качестве промежуточного продукта образуется ион карбония, поскольку ковалентный промежуточныйпродукт,показанныйнасреднемрисунке,былобнаружентольковреакцииссинтети-

ческимсубстратом.(См.D. J. Vocadloetal.,Nature412:835–838,2001.)

1.Фермент вызывает напряжения в связанном им субстрате, так что форма одного из сахаров напоминает форму переходных состояний с высокой энергией, образующихся в ходе реакции.

2.Отрицательно заряженная аспарагиновая кислота реагирует с атомом углерода C1 искаженного сахара, а глутаминовая кислота жертвует свой протон кислороду, который связывает этот сахар с соседним. В результате связь между этими двумя сахарами расщепляется, и боковая цепь аспарагиновой кислоты остается ковалентно связанной с С1, по которому и произошло расщепление связи.

3.При помощи отрицательно заряженной глутаминовой кислоты молекула воды реагирует с атомом углерода C1, вытесняя боковую цепь аспарагиновой кислоты

изавершая процесс гидролиза.

250 Часть 1. Введение в мир клетки

Полная химическая реакция — от начального связывания полисахарида на поверхности фермента и до заключительного высвобождения разобщенных цепей происходит во много миллионов раз быстрее, чем протекала бы в отсутствие фермента.

Другие ферменты используют подобные механизмы для снижения энергии активации и ускорения реакций, которые они катализируют. В реакциях, где во взаимодействие вовлечено два и более агентов, активный участок служит также и матрицей, или шаблоном, на которой, или соответственно котором, эти субстраты «сводятся вместе» в надлежащей ориентации так, что реакция между ними становится возможной (рис. 3.52, а). Как мы видели на примере лизоцима, атомы, входящие в активный участок фермента, размещены очень точно, чтобы ускорять реакцию за счет использования своих заряженных групп для изменения распределения электронов в субстратах (рис. 3.52, б). Кроме того, когда субстрат связывается с ферментом, связи в субстрате часто искажаются, изменяя форму субстрата. Эти изменения, наряду с механическими силами, продвигают субстрат к специфическому переходному состоянию (рис. 3.52, в). Наконец, подобно лизоциму, многие ферменты оказываются глубоко вовлеченными в реакцию и даже образуют кратковременную ковалентную связь между субстратом и боковой цепью входящей в активный центр аминокислоты фермента. На последующих этапах реакции боковая цепь возвращается в свое исходное состояние, так что сам фермент остается неизмененным после реакции (см. также рис. 2.72).

Рис. 3.52. Некоторые общие принципы ферментативного катализа. а) Удерживать субстраты вместе в точно заданном взаимном расположении. б) Стабилизировать промежуточные продукты реакции путемперераспределениязарядов.в)Приложитьсилу,котораяискажаетсвязивсубстрате,итемсамым увеличитьскоростьопределеннойреакции.

3.2.12.  Прочно связанные с белками небольшие молекулы придают белкам дополнительные функции

Хотя мы и подчеркивали многофункциональность белков как аминокислотных цепей, которые выполняют различные функции, известно много примеров, в которых самих по себе цепочек аминокислот недостаточно. Точно так же как люди употребляют инструменты, чтобы увеличить и расширить возможности своих рук, белки часто используют маленькие небелковые молекулы, чтобы выполнять

Глава 3. Белки 251

функции, которые было бы трудно или невозможно выполнить, располагая одними лишь аминокислотами. Так, белок сигнальных рецепторов родопсин, который производится фоторецепторными клетками сетчатки, обнаруживает свет посредством маленькой, заложенной в него, молекулы ретиналя (рис. 3.53, а). Когда ретиналь поглощает фотон света, он изменяет свою форму, и это изменение заставляет белок запускать каскад ферментативных реакций, которые в конечном счете ведут к посылке электрического сигнала мозгу.

Рис. 3.53. Ретиналь и гем. а) Структура ретиналя — светочувствительной молекулы, присоединенной кродопсину(основномузрительномупигменту).б)Структурагруппыгема.Содержащееуглеродкольцо гемаотмеченокрасным,аатомжелезавегоцентреокрашеноранжевым.Группагемапрочносвязана совсемичетырьмяполипептиднымицепямивгемоглобине—переносящемкислородбелке,структура которогопоказананарис.3.22.

Другим примером белка, содержащего небелковую часть, служит гемоглобин (см. рис. 3.22). Молекула гемоглобина несет четыре группы гема — кольцеобразные молекулы, в центре каждой из которых находится один атом железа (рис. 3.53, б). Гем придает гемоглобину (да и всей крови) характерный для нее красный цвет. Благодаря обратимому связыванию с газообразным кислородом через заложенный в нем атом железа гем позволяет гемоглобину вбирать кислород в легких и выпускать его в тканях.

Иногда такие маленькие молекулы присоединены ковалентно и постоянно

ксвоему белку и, таким образом, становятся неотъемлемой частью самой белковой молекулы. Из главы 10 мы узнаем, что белки часто бывают прикреплены к клеточным мембранам посредством ковалентно присоединенных молекул липидов. А мембранные белки, выставленные на поверхности клетки, а также белки, выделяемые из клетки вовне, часто модифицированы ковалентно присоединенными

кним сахарами и олигосахаридами.

Всоставе ферментов часто имеется маленькая молекула или атом металла, которые прочно связаны с активным участком фермента и усиливают его каталитическую активность. Например, карбоксипептидаза — фермент, который разрезает полипептидные цепи, — несет в своем активном участке прочно связанный ион цинка. В процессе расщепления пептидной связи карбоксипептидазой ион цинка образует переходную связь с одним из атомов субстрата, способствуя таким образом реакции

252 Часть 1. Введение в мир клетки

гидролиза. У иных ферментов подобной цели служит небольшая органическая молекула. Такие органические молекулы часто упоминаются как коферменты. Примером является биотин, встречающийся в ферментах, которые переносят карбоксильную группу (–COO–) с одной молекулы на другую (см. рис. 2.63). Биотин участвует в таких реакциях путем образования переходной ковалентной связи с готовой к переносу группой –COO–, причем он подходит для этой функции лучше, чем любая из аминокислот, идущих на построение белка. Поскольку биотин не может быть синтезирован организмом человека и поэтому должен содержаться в малых количествах в нашей пище, он относится к витаминам. Многие другие коферменты синтезируются из витаминов (таблица 3.2). Витамины необходимы также и для того, чтобы синтезировать небольшие молекулы других типов, которые являются незаменимыми партнерами наших белков; витамин A, например, необходим в рационе, чтобы синтезировать ретиналь — светочувствительную часть родопсина.

Таблица3.2.Многиевитаминыявляютсяисточникамиважнейшихкоферментовдляклетокчеловека

ВИТАМИН	КОФЕРМЕНТ	ФЕРМЕНТАТИВНО КАТАЛИЗИРУЕМЫЕ
		РЕАКЦИИ, ДЛЯ КОТОРЫХ НЕОБХОДИМ
		ЭТОТ КОФЕРМЕНТ
Тиамин (витамин В1)	тиаминпирофосфат	активация и перенос альдегидов
Рибофлавин (витамин В2)	FADH2	окисление-восстановление
Никотиновая кислота	NADH, NADPH	оксиление-восстановление
(витамин РР)
Пантотеновая кислота	кофермент А	активация и перенос ацильной группы
(витамин В3)
Пиридоксин (витамин В6)	пиридоксальфосфат	активация аминокислот,
		а также гликогенфосфорилаза
Биотин (витамин Н)	биотин	активация и перенос СО2
Липоевая кислота (витамин N)	липоамид	активация ацильной группы;
		окисление-восстановление
Фолиевая кислота (витамин В9)	тетрагидрофолат	активация и перенос одноуглеродных
		групп
Цианкобаламин (витамин В12)	кобаламины	изомеризация; перенос метильной
		группы

3.2.13.  В ферментах со множественными каталитическими участками субстраты движутся по особым внутримолекулярным туннелям

В ходе некоторых химических реакций, катализируемых ферментами в клетках, образуются промежуточные продукты, которые или являются очень неустойчивыми, или могут легко диффундировать из клетки сквозь плазматическую мембрану, будучи в цитозоле. Чтобы сохранить за собой такие промежуточные продукты, ферменты используют полученные в ходе эволюции молекулярные туннели, которые соединяют два и более активных участка и позволяют быстро превращать промежуточный продукт, который при этом не покидает фермента, в конечный продукт.

Рассмотрим, например, фермент карбамоилфосфатсинтетазу, который использует аммиак, полученный из глутамина, и две молекулы ATP, чтобы превращать бикарбо-

Глава 3. Белки 253

нат (HCO3–) в карбамоилфосфат — важный промежуточный продукт в нескольких метаболических путях (рис. 3.54). Этот фермент содержит три далеко отстоящих друг от друга активных участка, которые соединены друг с другом посредством туннеля. Реакция начинается на активном участке 2, расположенном в середине туннеля, с использованием ATP для фосфорилирования (присоединения фосфатной группы) бикарбоната и заканчивается образованием карбоксифосфата. Это событие запускает гидролиз глутамина до глутаминовой кислоты на активном участке 1, что сопровождается высвобождением аммиака в туннель. Аммиак немедленно диффундирует через первую половину туннеля к активному участку 2, где реагирует с карбоксифосфатом — с образованием карбамината. Далее этот неустойчивый промежуточный продукт диффундирует через вторую половину туннеля к активному участку 3, где фосфорилируется ATP до конечного продукта — карбамоилфосфата.

Рис.3.54.Туннелированиепромежуточных продуктовреакциивферментекарбамоил-

фосфатсинтетазе.а)Схематичноеизображениеструктурыфермента,вкоторомкрасная лента используется для обозначения туннеля, проходящего во внутренней части белка и соединяющего три его активных участка. Малаяибольшаясубъединицыэтогодимерного фермента отмечены соответственно желтымисинимцветами.б)Схемареакции. Какотмечено,активныйучасток1производит аммиак,которыйдиффундируетпотуннелю кактивномуучастку2,гдесоединяетсяскарбоксифосфатомсобразованиемкарбамината.Затемэтотвесьманестойкийпромежуточный продукт диффундирует сквозь туннель кактивномуучастку3,гдефосфорилируется ATPинаконецпревращаетсявконечныйпродукт — карбамоилфосфат. (Изображение а переработаноизF. M. Raushel,J. B. Thoden,and H. M. Holden,Acc.Chem.Res.36:539–548,2003. СразрешенияAmericanChemicalSociety.)

254 Часть 1. Введение в мир клетки

Некоторые другие хорошо охарактеризованные ферменты также содержат подобные молекулярные туннели. Аммиак — легко диффундирующий промежуточный продукт, который иначе мог быть утрачен клеткой, — является субстратом, который, как теперь известно, чаще всего направляется по ферментативным туннелям.

3.2.14.  Мультиферментные комплексы помогают увеличить скорость метаболизма в клетке

Эффективность ферментов в плане ускорения химических реакций является крайне важной для поддержания жизни. Клетки, в сущности, должны бежать наперегонки с неизбежными процессами распада, которые — если позволить им уйти вперед — заставят макромолекулы скатываться вниз ко все большему и большему беспорядку. Если бы скорости желательных реакций не были выше, чем скорости конкурирующих побочных реакций, то клетка вскоре умерла бы. Мы можем получить некоторое представление о скорости протекания метаболизма в клетке, измеряя скорость использования ATP. Типичная клетка млекопитающих «оборачивает» (то есть гидролизирует и восстанавливает фосфорилированием) резерв ATP в полном объеме за 1–2 минуты. Для каждой клетки такая оборачиваемость означает использование примерно 107 молекул ATP в секунду (или, для всего организма человека, приблизительно 1 грамм ATP каждую минуту).

Скорости реакций в клетках велики именно благодаря столь высокой эффективности ферментативного катализа. Многие важные ферменты стали настолько эффективными, что нет никакой необходимости в дальнейшем усовершенствовании. Фактор, который ограничивает скорость реакции, более не определяется свойственной ферменту скоростью действия; скорее, он обусловлен частотой, с которой фермент сталкивается со своим субстратом. Говорят, что такая реакция является

диффузионно-лимитированной (см. приложение 3.3, стр. 244–245).

Если скорость катализируемой ферментом реакция лимитирована диффузией, то она зависит от концентрации и самого фермента, и его субстрата. Если нужно, чтобы некоторая последовательность реакций происходила чрезвычайно быстро, то каждый промежуточный продукт метаболизма и участвующий в реакциях фермент должны присутствовать в высокой концентрации. Однако, ввиду огромного числа различных реакций, выполняемых клеткой, существуют пределы концентраций, которые реально могут быть достигнуты. Фактически большинство метаболитов присутствует в микромолярных (10–6 моль/литр) концентрациях, а концентрации большинства ферментов намного ниже. Как же при таком раскладе возможно поддерживать очень быстрые скорости метаболических реакций?

Ответ кроется в пространственной организации компонентов клетки. Клетка способна увеличивать скорости реакций, не повышая концентрации субстратов, за счет сведения различных ферментов, участвующих в последовательности реакций, воедино и образования из них крупного белкового ансамбля, известного под названием мультиферментного комплекса (рис. 3.55). Поскольку это позволяет передавать продукт фермента А непосредственно ферменту B и так далее, интенсивность диффузии уже не должна ограничивать скорость реакции, даже когда концентрации субстратов в клетке в целом очень низки. Поэтому не должен вызывать удивления тот факт, что такие ферментные комплексы довольно распространены и есть почти во всех «закоулках» метаболических путей, включая ключевые генетические процессы синтеза ДНК, РНК и белка. Фактически лишь немногие ферменты в эукариотических клетках свободно диффундируют в растворе; вместо этого,

Глава 3. Белки 255

Рис. 3.55. Структура пируватдегидрогеназы. Этот ферментный комплекс катализирует превращение пируватавacetylCoА–реакция,являющаясясоставнойчастьюпутиокислениясахарадоCO2 иH2O(см. рис.2.79).Пируватдегидрогеназаслужитпримеромкрупногомультиферментногокомплекса,вкотором промежуточныепродуктыреакциинепосредственнопередаютсяотодногоферментакдругому.

большинство, кажется, выковало в кузнице эволюции такие участки связывания, благодаря которым они группируются с другими белками родственной функции

вопределенных областях клетки, увеличивая тем самым скорость и эффективность катализируемых ими реакций.

Эукариотические клетки располагают еще одним способом повышения скорости метаболических реакций — использование систем внутриклеточных мембран. Эти мембраны могут заключать определенные субстраты и ферменты, которые воздействуют на них, в одну и ту же обособленную мембраной полость, такую как эндоплазматический ретикулум или ядро клетки. Если, например, некоторая полость занимает в целом 10 % от общего объема клетки, то концентрация реагентов в этой полости будет увеличена в 10 раз по сравнению с концентрацией этих же молекул

вклетке с тем же числом молекул фермента и субстрата, но без «распределения» по полостям. Таким вот образом реакции, ограниченные скоростью диффузии, могут быть ускорены в 10 раз.

3.2.15.  Каталитическое действие ферментов регулируется самой клеткой

Живая клетка включает в себя тысячи ферментов, многие из которых работают одновременно и в общем малом объеме цитозоля. Своим каталитическим действием эти ферменты создают сложную сеть метаболических путей, каждый из которых состоит из цепочек химических реакций, в которых продукт одного фермента становится субстратом следующего. В таком лабиринте путей есть много точек ветвления (узлов), в которых различные ферменты конкурируют за один и тот же субстрат. Подобная система настолько сложна (см. рис. 2.88), что для регулирования того, в какой момент времени и как быстро каждая из реакций должна произойти, необходим сложный контроль.

Регуляция осуществляется на многих уровнях. На одном уровне клетка управляет тем, сколько молекул каждого из ферментов она производит, путем регулирования экспрессии генов, кодирующих эти ферменты (обсудим подробнее в главе 7). Клетка управляет активностью ферментов также и за счет заключения наборов этих ферментов в специфические субклеточные полости, окруженные обособленными

256 Часть 1. Введение в мир клетки

Рис.3.56.Торможениепотипуобратнойсвязинаотдельно взятомпутибиосинтеза.КонечныйпродуктZингибируетпервыйфермент,которыйявляетсяуникальнымдляегосинтеза, итемсамымуправляетуровнемсвоейконцентрациивклетке. Этопримеротрицательнойрегуляции.

мембранами (обсуждается в главах 12 и 14). Как будет сказано позже в этой главе, ферменты часто ковалентно модифицируются – для регулирования их активности. Скорость разрушения белка

целенаправленным протеолизом представляет

еще один важный регуляторный механизм (см. разд. 6.2.22). Но самый общий процесс, посредством которого выверяются скорости реакций,

работает через прямое, причем обратимое изменение активности фермента в ответ на определенные маленькие молекулы, с которыми он встречается.

Регуляция самого распространенного типа происходит, когда некая молекула, не входящая в репертуар субстратов, связывается с ферментом в специальном регуляторном участке, расположенном вне активного центра, и за счет этого изменяет скорость, с которой фермент превращает свои субстраты в продукты. Например, при ингибировании по типу обратной связи продукт, производимый на более позднем участке цепочки реакций, ингибирует фермент, который действует на более раннем этапе их протекания. Таким образом, всякий раз, когда начинает накапливаться большое количество конечного продукта, он связывается с ферментом и замедляет каталитическое действие, чем ограничивает дальнейший расход субстратов в этой реакции (рис. 3.56). В тех местах, где пути ветвятся или пересекаются, находится обычно множество рычагов управления, осуществляемого с привлечением различных конечных продуктов, каждый из которых выступает регулировщиком своего собственного синтеза (рис. 3.57). Ингибирование по типу обратной связи может срабатывать почти мгновенно, и система может быстро возвращаться к исходному состоянию после падения уровня концентрации продукта.

Ингибирование по типу обратной связи представляет собой, по сути, отрица- тельную регуляцию – оно препятствует деятельности фермента. Ферменты могут подвергаться также и положительной регуляции, когда регулирующая молекула стимулирует действие фермента, вместо того чтобы приостанавливать его. Положительная регуляция имеет место, когда продукт в одной ветви метаболической сети стимулирует активность некоторого фермента на другом пути. В качестве одного из примеров положительной регуляции можно привести следующий: накопление ADP активирует несколько ферментов, участвующих в окислении молекул сахара, и таким образом стимулирует клетку для превращения бóльших объемов ADP в ATP.

3.2.16.  Аллостерические ферменты обладают двумя и более взаимно влияющими друг на друга участками связывания лигандов

Поразительная особенность как положительной, так и отрицательной регуляции по типу обратной связи заключается в том, что молекула-регулятор часто имеет форму, совершенно отличную от формы субстрата данного фермента. Именно поэтому воздействие на белок называют аллостерией (от греческих слов allos, означающего

Глава 3. Белки 257

Рис. 3.57. Многократное ингибирование по типу обратной связи. В данном примере, который по-

казывает пути биосинтеза четырех различных аминокислот в бактериях, красные стрелки отмечают положения,вкоторыхпродуктыингибируютферментыпотипуобратнойсвязи.Каждаяаминокислота контролируетработупервогофермента,специфическогоименнодляеесинтеза,итемсамымрегулирует свой собственный уровень, предотвращая возможность расточительного или даже опасного накопленияпромежуточныхпродуктов.Конечныепродуктымогутингибироватьтакжеи«пакет»изначальных реакций, общий для всех последующих реакций их синтеза; в данном случае начальную реакцию катализируюттриразличныхфермента,каждыйизкоторыхингибируетсяопределенным,отличнымот других,конечнымпродуктом.