Volume1

268 Часть 1. Введение в мир клетки

Рис. 3.66. Эволюционное дерево избранных протеинкиназ. Хотя всякая клетка высших эукариот со-

держитсотнитакихферментов,агеномчеловекакодируетболее500,лишьнекоторыеизупоминаемых вэтойкнигепоказанынаданномрисунке.

фатные группы на белках непрерывно оборачиваются — присоединяются и затем быстро удаляются. Такие циклы фосфорилирования могут показаться неэкономными, но они важны уже лишь тем, что позволяют фосфорилируемым белкам быстро переключаться из одного состояния в другое: чем быстрее цикл, тем быстрее совокупность белковых молекул может изменить свое состояние фосфорилирования в ответ на внезапное изменение скорости фосфорилирования (см. рис. 15.11). Энергия, необходимая для подпитки такого цикла фосфорилирования, поступает от гидролиза ATP – на одно событие фосфорилирования расходуется одна молекула ATP.

3.2.22.  Регулирование Cdk- и Src-протеинкиназ показывает,

каким образом белок может функционировать в качестве микрочипа

Сотни различных протеинкиназ, находящихся в ядерной клетке, организованы в сложные сети путей передачи сигналов, которые помогают координировать действия клетки, осуществлять клеточный цикл и проводить сигналы в клетку из окружающей ее среды. Нужно, чтобы многие из пробегающих по этой сети внеклеточных сигналов и интегрировались и усиливались клеткой. Отдельные протеинкиназы (равно как и прочие сигнальные белки) служат своеобразными устройствами ввода-вывода, или «микрочипами», в процессе интеграции сигналов. Важный вклад в такие обрабатывающие сигналы системы белков вносит регулирование их «работы» путем присоединения к ним и удаления с них фосфатов соответственно протеинкиназами и протеинфосфатазами.

Глава 3. Белки 269

Вообще, если одни наборы фосфатных групп служат для активации белка, то другие наборы могут инактивировать его. Хорошим примером служит циклинзависимая протеинкиназа (Cdk). Киназы этого класса фосфорилируют серин и треонин и выступают ключевыми составляющими системы управления клеточным циклом в клетках эукариот, о чем будет подробно рассказано в главе 17. В клетке позвоночных отдельные белки Cdk включаются и выключаются в определенной последовательности, по мере того как клетка проходит различные этапы цикла деления. Когда киназа активна, она влияет на различные моменты поведения клетки за счет воздействий на фосфорилируемые ею белки.

Белок Cdk начинает проявлять действие серин/треонинпротеинкиназы только будучи связанным со вторым белком, названным циклином. Но, как видно на рис. 3.67, связывание циклина есть лишь один из трех разных «вводов», необходимых для активации Cdk. В дополнение к связыванию циклина, к боковой цепи определенного треонина должен быть присоединен фосфат, а в другом месте белка должен быть удален один фосфат (ковалентно связанный с боковой цепью определенного тирозина). Cdk, таким образом, отслеживает определенный набор компонентов клетки: циклин, протеинкиназа и протеинфосфатаза — и выступает устройством «ввода-вывода», которое включается тогда и только тогда, когда все эти компоненты достигают положенного им состояния активности. Концентрация некоторых циклинов растет и падает в ногу с клеточным циклом, постепенно повышаясь в количестве, пока они внезапно не будут разрушены в определенной точке цикла. Внезапное разрушение циклина (путем целенаправленного протеолиза) немедленно выключает его партнера — фермент Cdk, и это событие запускает определенный этап клеточного цикла.

Поведение семейства Src-протеинкиназ (см. рис. 3.10) тоже напоминает работу микрочипов — по аналогии с вышеописанным. Белок Src (произносится «сарк» и назван по имени типа опухоли — саркомы, — которую прекращение его регулирования может вызвать) был первым из открытых тирозинкиназ. Он, как ныне известно, является частью подсемейства из девяти весьма подобных протеинкиназ, которые обнаружены только у многоклеточных животных. Как видно по эволюционному дереву на рис. 3.66, сравнения последовательностей говорят о том, что тирозинкиназы как группа были относительно поздним новшеством, которое ответвилось от серин/треонинкиназ, причем подсемейство Src является только одной из

нескольких подгрупп тирозинкиназ, появившихся таким способом.

Белок Src и родственные ему белки содержат короткую N-концевую область, которая ковалентно связана с сильно гидрофоб-

ной жирной кислотой, что удерживает киназу у соприкасающейся с цитоплазмой стороны плазматической мембраны. Затем идут два связывающихся с пептидом модуля, гомоло-

Рис.3.67.КакбелокCdkвыполняетрольинтегрирую-

щего устройства. Функция этих главных регуляторов клеточногоциклаобсуждаетсявглаве17.

270 Часть 1. Введение в мир клетки

гичный Src домен 3 (SH3) и домен SH2, за которыми следует каталитический домен киназы (рис. 3.68). Такие киназы обычно пребывают в неактивной конформации, в которой фосфорилированный тирозин около C-конца связан с доменом SH2, а домен SH3 связан с внутренним пептидом, в результате чего активный участок фермента оказывается искаженным, что способствует его переходу в неактивное состояние.

Рис.3.68.ДоменнаяструктурасемействаSrc-протеинкиназ,нанесеннаянакартупоследовательности аминокислот.ЖелающимувидетьтрехмернуюструктуруSrcследуетобратитьсякрис.3.10.

В активацию киназы вовлечены по крайней мере два определенных процесса: удаление C-концевого фосфата и связывание с доменом SH3 специфического активирующего белка (рис. 3.69). Подобно активации белка Cdk, активация Src-киназы сигнализирует о завершении череды отдельных событий и о ее готовности войти в череду следующих (рис. 3.70). Таким образом, и семейство Cdk и семейство Src-белков служат своеобразными интеграторами сигналов и способствуют организации сложной сети событий обработки информации, которая позволяет клетке выстраивать логические ответы на сложный набор условий.

Рис.3.69.АктивацияпротеинкиназыSrc-типадвумяпоследовательнымисобытиями.(Переработано изS. C. Harrisonetal.,Cell112:737–740,2003.СлюбезногоразрешенияиздательстваElsevier.)

3.2.23.  Белки, которые связывают и гидролизуют GTP, суть вездесущие клеточные регуляторы

Мы описали то, как процессы присоединения к белку фосфатных групп или их удаления с него могут быть использованы клеткой для управления активностью этого белка. В доселе рассмотренных нами примерах фосфат переносится с молекулы ATP на боковую цепь входящей в состав белка аминокислоты в ходе реакции, катализируемой определенной протеинкиназой. Клеткам эукариот знаком

Глава 3. Белки 271

Рис. 3.70. Принцип работы протеинкиназы Src-типа в качестве интегрирующего устройства. Нарушение взаимодействиясдоменомSH3(зеленый)состоитвзаменеегосвязываниясобозначеннойкраснымсвязующей областью на более сильное связывание с активирующимлигандом,какпоказанонарис.3.69.

также и другой способ управления активностью белка путем присоединения и уда-

ления фосфата. В этом случае фосфат не присоединяется непосредственно к белку; вместо этого, он является частью гуаниново-

го нуклеотида GTP, который очень прочно связывается с белком. Вообще, белки, регулируемые таким способом, находятся в своих активных конформациях, будучи связаны

с GTP. Потеря фосфатной группы происходит, когда связанный GTP гидролизуется до GDP в ходе реакции, катализируемой самим белком, и в таком связанном с GDP

состоянии белок неактивен. Таким способом GTP-связывающие белки работают двухпо-

зиционными переключателями, активность которых определяется присутствием или отсутствием дополнительного фосфата на связанной молекуле GDP (рис. 3.71).

Рис.3.71.GTP-связывающиебелкивролимолекулярныхпереключателей.ДляактивностиGTP-связы-

вающего белка (называемого также GTPазой), как правило, необходимо присутствие прочно связанной молекулыGTP(состояние«включено»).ГидролизэтоймолекулыGTPдаетGDPинеорганическийфосфат(Pi), чтопобуждаетбелокперейтивдругую,обычнонеактивную,конформацию(состояние«выключено»).Как показанонаэтомрисунке,длявозвратапереключателявисходноесостояниенеобходимо,чтобыпрочно связанныйGDPотделилсяотфермента,—медленнаястадия,котораязначительноускоряетсяопределен- нымисигналами;кактолькоGDPотделился,молекулаGTPвновьбыстроприсоединяетсякбелку.

GTP-связывающие белки (называемые также GTPаза ввиду катализируемого ими гидролиза GTP) охватывают большое семейство белков, все из которых содержат разновидности одного и того же связывающего GTP глобулярного домена. Когда прочно связанный GTP гидролизуется до GDP, этот домен подвергается конформационному изменению, в результате которого инактивируется. Трехмерная структура прототипного члена этого семейства, мономерной GTPазы, известной под названием Ras, показана на рис. 3.72.

272 Часть 1. Введение в мир клетки

Рис.3.72.СтруктурабелкаRasвсвязаннойсGTPформе.ЭтамономернаяGTPазаиллюстрируетструктуру связывающего GTP домена, наличие коего характерно для членов большого семейства GTP-связывающих белков.Красныеобластиизменяютсвоюконформацию,когдамолекулаGTPгидролизуетсябелкомдоGDP инеорганическогофосфата;GDPостаетсясвязаннымсбелком,анеорганическийфосфатвысвобождается.Специальнаяроль«переключающейспирали»вбелках,связанныхсRas,объясняетсядалее(см.рис.3.75).

Белок Ras играет важную роль в передаче сигналов в клетках (обсуждается

вглаве 15). В связанной с GTP форме он активен и стимулирует каскад реакций фосфорилирования белка в клетке. Бóльшую часть времени, однако, белок находится в неактивной, связанной с GDP форме. Он становится активным, когда заменяет свою молекулу GDP на молекулу GTP в ответ на внеклеточные сигналы, такие как факторы роста, которые связываются с рецепторами, находящимися

вплазматической мембране (см. рис. 15.58).

3.2.24.  Регуляторные белки управляют активностью GTP связывающих белков, побуждая их к связыванию либо GTP, либо GDP

GTP-связывающие белки управляются регуляторными белками, которые решают, будет ли с ними связан GTP или GDP, точно так же как фосфорилируемые белки включаются и выключаются протеинкиназами и протеинфосфатазами. Так Ras

инактивируется активирующим GTPазу белком (GAP; GTPase-activating protein),

который связывается с белком Ras и побуждает его гидролизировать связанную им молекулу GTP до GDP — которая остается прочно связанной, — и неорганического фосфата (Pi), который быстро высвобождается. Белок Ras остается в своей бездействующей, GDP-связанной конформации, пока не сталкивается с фактором

обмена нуклеотида гуанина (GEF; guanine nucleotide exchange factor), который

Глава 3. Белки 273

связывается с комплексом GDP–Ras и вынуждает его высвободить молекулу GDP. Поскольку пустой участок связывания нуклеотида незамедлительно занимается молекулой GTP (в клетках GTP присутствует в большом избытке над GDP), GEF активирует Ras путем косвенного возвращения фосфата, удаленного в ходе гидролиза GTP, на свое исконное место. Таким образом, в некотором смысле роли GAP и GEF аналогичны соответственно протеинфосфатазе и протеинкиназе (рис. 3.73).

Рис.3.73.Сравнениедвухглавныхвнутриклеточныхмеханизмовпередачисигналоввклеткахэукариот.

Вобоихслучаяхсигнальныйбелокактивируетсязасчетприсоединенияфосфатнойгруппыиинактивируетсяпосредствомудаленияэтогофосфата.Длятогочтобыподчеркнутьсходствоэтихдвухпутей,ATP иGTPпредставленысоответственноввидеAPPPиGPPP,аADPиGDP—ввидеAPPиGPP.Какпоказано нарис.3.64,присоединениефосфатакбелкуможетоказыватьиингибирующеедействие.

3.2.25.  Небольшие движения в белках могут приводить к масштабным изменениям

Белок Ras принадлежит к большому надсемейству мономерных GTPаз, каждая из которых состоит из единственного GTP-связывающего домена размером приблизительно 200 аминокислот. В ходе эволюции этот домен присоединился также и к более крупным белкам с дополнительными доменами, в результате чего образовалось многочисленное семейство GTP-связывающих белков. Члены этого семейства включают связанные с рецепторами тримерные G-белки, участвующие в передаче сигналов в клетках (обсудим в главе 15); белки, регулирующие движение пузырьков между внутриклеточными полостями (обсудим в главе 13); и белки, которые связываются с транспортной РНК и востребованы в качестве факторов

274 Часть 1. Введение в мир клетки

сборки для синтеза белка в рибосоме (рассмотрим в главе 16). В каждом случае жизненно важная биологическая функция управляется изменением конформации белка, вызываемым гидролизом GTP в домене, подобном Ras.

Хорошим примером принципа действия белков этого семейства служит белок EF-Tu. В клетке EF-Tu присутствует в большом количестве, выполняя роль фактора элонгации (продления цепи — отсюда название EF — elongation factor) в ходе синтеза белка: EF-Tu осуществляет погрузку молекул аминоацил-тРНК на рибосому. Молекула тРНК образует прочный комплекс с GTP-связанной формой EF-Tu (рис. 3.74). В этом комплексе аминокислота, прикрепленная к тРНК, размещена таким образом, что не может участвовать в синтезе белка. тРНК может отдать связанную с ней аминокислоту только после того, как связанный с EF-Tu GTP будет гидролизирован на рибосоме, что позволит EF-Tu отсоединиться. Поскольку гидролиз GTP запускается точным соответствием молекулы тРНК молекуле мРНК на рибосоме, EF-Tu выполняет функцию фактора, который различает правильные и неправильные пары мРНК–тРНК (рис. 6.67 служит отправной точкой для дальнейшего экскурса на тему этой функции EF-Tu).

Сравнивая трехмерные структуры EF-Tu в его связанной с GTP и GDP формах, можно видеть, как происходит изменение положения тРНК. Отделение группы неорганического фосфата (Pi), которым сопровождается реакция GTP → GDP + Pi, вызывает сдвиг на несколько десятых нанометра в участке связывания GTP, так же как это происходит в белке Ras. Этот ничтожно малый сдвиг, равный нескольким диаметрам атома водорода, вызывает конформационное изменение, которое распространяется по важнейшей части α-спирали, названной переключающей спиралью (switch helix), в Ras-подобном домене этого белка. Переключающая спираль напоминает своеобразную защелку, которая будучи сцеплена с определенным участком в другом домене молекулы, удерживает белок в «замкнутой» конформации. Конформационное изменение, запускаемое гидролизом GTP, заставляет переключающую спираль раскрываться, отпуская связанные с ней домены, которые выворачиваются в сторону на расстояние приблизительно

4 нм. В результате этого связанная молекула тРНК высвобождается, а бывшая с ней аминокислота получает возможность быть встроенной в полипептид

(рис. 3.75).

В этом примере интересно обратить внимание на то, как клетки используют энергию простой химической реакции, которая происходит на поверхности маленького белкового домена, чтобы произвести движение в 50 раз большее по размаху. При значительных изменениях подобного типа происходят очень большие передвижки, как в двигательных, или моторных, белках, о чем мы поговорим позже.

Рис.3.74.Аминоацил-тРНК,связанаясEF-Tu.Тридоменабелка

EF-Tuокрашеныпо-разному,соответственноцветамнарис.3.75. Этобактериальныйбелок;однаковесьмаподобныйбелоксуще- ствуетуэукариот;егоназываютEF-1.(ИзP. Nissenetal.,Science 270: 1464–1472, 1995. С любезного разрешения издательства

AAAS.)

Глава 3. Белки 275

Рис. 3.75. Важнейшее конформационное изменение в EF-Tu, вызываемое гидролизом GTP. а) Трех-

мерная структура EF-Tu со связанным с ним GTP. Домен сверху имеет структуру, подобную белку Ras, иегокраснаяα-спиральявляетсяпереключающейспиралью,котораясмещаетсяпослегидролизаGTP. б)Изменениеконформациипереключающейспираливдомене1вызываетповоротдоменов2и3как целостной единицы примерно на 90° в сторону наблюдателя, в результате чего высвобождается тРНК, котораябылапоказанасвязаннойсэтойструктуройнарис.3.74.(Рис.апереработанизH. Berchtoldetal., Nature365:126–132,1993.СлюбезногоразрешенияиздательстваMacmillanPublishersLtd.Изображениеб любезнопредоставилиMathiasSprinzlиRolfHilgenfeld.)

3.2.26.  Движение в клетках обеспечивают моторные белки

Мы узнали, что конформационные изменения в белках играют центральную роль в регуляции работы ферментов и передаче сигналов в клетках. Теперь мы обсудим белки, главная функция которых заключается в перемещении других молекул. Такие моторные белки генерируют силы, за счет которых осуществляется сокращение мышц, а также ползание и плавание клеток. Моторные белки ответственны также и за внутриклеточные движения гораздо меньшего масштаба: они помогают перемещать хромосомы к противоположным концам клетки во время митоза (обсуждается в главе 17), передвигать органеллы по молекулярным путям

впределах клетки (обсуждаем в главе 16) и перемещать ферменты по цепи ДНК

впроцессе синтеза новой молекулы ДНК (обсуждается в главе 5). Все эти основополагающие процессы зависят от белков, в состав которых входят двигательные домены и которые являются своего рода силовыми машинами.

Как такие машины работают? Другими словами, как клетки используют изменения формы в белках, чтобы производить направленные движения? Если, например, белок должен идти по узкой нити типа молекулы ДНК, он может делать это за счет прохождения через ряд конформационных изменений наподобие представленных на рис. 3.76. Но не имея ничего, что могло бы осуществлять эти изменения в строгой

276 Часть 1. Введение в мир клетки

Рис. 3.76. Аллостерический «шагающий» белок. Хотя три его различные конформации позволяют ему «шагать» назад и вперед, будучи связанным сволокномилифиламентом,этотбелокнеспособенравномернопередви- гатьсявкаком-либоодномнаправлении.

последовательности, они будут абсолютно обратимы, и белок

обречен лишь беспорядочно блуждать по нити взад и вперед.

Мы можем взглянуть на эту ситуацию иначе. Так как имеет место направленное движение белка, законы термодинамики (рассмотренные нами в главе 2) требуют, чтобы такое движение использовало свободную энергию из какого-то другого источника (в противном случае такой белок мог бы быть использован для создания вечного двигателя). Следовательно, без подачи энергии молекула белка может лишь скитаться

туда-сюда безо всякой цели.

Как клетка может сделать такой ряд конформационных изменений однонаправленным? Чтобы полный цикл протекал лишь в одном направлении, достаточно сделать какое-либо одно из изменений формы необратимым. Бóльшая часть белков, которые способны продвигаться в одном направлении на боль-

шие расстояния, достигает этого за счет сопряжения одного из конформационных изменений с гидролизом связанной с ними молекулы ATP. Механизм подобен только что описанному — который питает изменения формы аллостерического белка энергией гидролиза GTP. Поскольку при гидролизе ATP (или GTP) высвобождается боль-

шая порция свободной энергии, очень маловероятно,

что связывающий нуклеотид белок претерпит обратное

изменение формы, необходимое для движения назад,

так как для этого потребовалось бы, чтобы он обратил

вспять также и гидролиз ATP, добавляя молекулу фосфата к ADP с воссозданием ATP.

В модели, показанной на рис. 3.77, связывание

ATP переводит моторный белок из конформации 1

в конформацию 2. После этого связанный ATP ги-

дролизуется с образованием ADP и неорганического фосфата (Pi), что вызывает изменение конформации 2 в конформацию 3. Наконец, высвобождение свя-

занных ADP и Pi переключает белок обратно в конформацию 1. Поскольку энергия, вырабатываемая

Рис. 3.77. Аллостерический моторный белок. Переход между тремя различными конформациями включает этап перемещения,которыйобусловленгидролизомсвязанноймолекулыATP, и благодаря этому полный цикл становится по существу необратимым. Поэтому, осуществляя повторные циклы, белок непрерывноперемещаетсявправопонити.

Глава 3. Белки 277

входе гидролиза ATP, расходуется на переход 2 →3, этот ряд конформационных изменений является фактически необратимым. Таким образом, полный цикл происходит только в одном направлении, в силу чего молекула белка непрерывно перемещается вправо, как показано в данном примере.

Многие моторные белки направляют движение именно таким общим способом,

втом числе и двигательный белок мышц миозин, который движется по актиновым филаментам, чтобы вызвать сокращение мышцы, и белки кинезины, которые передвигаются по микротрубочкам (оба белка будут подробнее рассмотрены в главе 16). Подобного рода движения могут быть быстрыми: некоторые моторные белки, участвующие в репликации ДНК (ДНК-хеликазы), продвигаются по нити ДНК с такими высокими скоростями, как 1 000 нуклеотидов в секунду.

3.2.27.  Связанные с мембраной переносчики используют энергию для перекачивания молекул через мембраны

К настоящему времени мы познакомились с тем, как аллостерические белки могут работать в качестве микрочипов (Cdk и Src-киназы), факторов сборки (EF-Tu) и генераторов механической силы и движения (моторные белки). Аллостерические белки могут также использовать энергию, полученную за счет гидролиза ATP, градиентов концентрации ионов или процессов переноса электронов, для перекачивания определенных ионов или малых молекул через мембраны. Здесь и сейчас мы рассмотрим один из таких примеров; другие же отложим до главы 11.

ABC-переносчики (АТР-binding cassete) образуют важный класс связанных с мембраной белков-насосов. У людей кодируют их по крайней мере 48 различных генов. Эти переносчики главным образом работают на экспорт гидрофобных молекул из цитоплазмы и тем самым выполняют, например, задачу удаления токсичных молекул у поверхности слизистой оболочки кишечного тракта или в гемоэнцефалическом барьере. Изучение ABC-переносчиков представляет большой интерес в клинической медицине, потому что перепроизводство белков этого класса вносит вклад в развитие устойчивости опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам. А у бактерий белки того же типа выполняют главным образом функцию импорта необходимых питательных веществ в клетку.

ABC-переносчик представляет собой тетрамер, состоящий из пары пронизывающих мембрану субъединиц, связанных с парой АТР-связывающих субъединиц, расположенных чуть ниже плазматической мембраны (рис. 3.78, а). Как и в других рассмотренных нами примерах, гидролиз связанных молекул ATP сопровождается конформационными изменениями в белке, причем такой силы, что это заставляет пронизывающие мембрану субъединицы перемещать связанные ими молекулы сквозь двойной липидный слой (рис. 3.78, б).

Люди изобрели множество различных типов механических насосов, и не должно выглядеть удивительным, что клетки тоже содержат привязанные к мембране насосы, которые, правда, работают иным образом. В числе наиболее примечательных — ротационные насосы, которые сопрягают гидролиз ATP с переносом ионов H+ (протонов). Эти насосы напоминают собой миниатюрные турбины и используются для подкисления внутренней среды лизосом и других органелл эукариот. Подобно другим ионным насосам, которые создают градиенты концентрации ионов, они могут выполнять обратную функцию и катализировать реакцию ADP + Pi → ATP, если установившийся в мембране градиент того иона, который они переносят, будет достаточно крутым.