senchuk_v_v_biohimiya_kurs_lekcii

цевой, а свободная -карбоксильная группа — С-концевой. Встречаются пептиды, не имеющие таких свободных функциональных групп. N-концевая -аминогруппа может подвергаться ацетилированию, а С-концевая — амидированию и др. Такие пептиды, как и циклические пептиды, не вступают в нингидриновую реакцию. Поскольку размеры пептидов не превышают 50 аминокислот, а часто и вовсе содержат не более 10—20 аминокислот, возникает явная неравномерность распределения всех 20 генетически кодируемых аминокислот в пептидах. Более того, в большинстве индивидуальных пептидов присутствуют далеко не все кодируемые аминокислоты.

Вместе с тем основные принципы и уровни структурной организации белков в значительной степени применимы и к пептидам. Одним из важнейших среди них является организация пептидных связей.

Пептидная связь между С-атомом -карбоксильной группы одной аминокислоты и N-атомом -аминогруппы другой аминокислоты, по существу, является амидной связью. Она образуется при участии фермента пептидилтрансфераза в процессе трансляции на рибосомах в результате ферментативной нуклеофильной атаки неподеленной пары электронов атома азота аминогруппы одной аминокислоты по С-атому активированного карбоксила другой аминокислоты. Атомы Н, С, О и N, располагаясь в одной плоскости в транс-конфигурации, формируют пептидную группировку, которая обладает особыми свойствами, во многом определяющими все последующие более сложные уровни структурной организации пептидов и белков.

Недавно обнаружены специальные клеточные белки циклофилины, которые осуществляют поддержание транс-конфигу- рации заместителей. В силу резонанса пептидная связь занимает промежуточное положение между обычной одинарной и обыч- ной двойной связями. Следовательно, невозможно вращение вокруг оси пептидной связи, а гибкость пептидной цепи определяется возможностью вращения вокруг связей асимметричных-углеродных атомов («шарнирные» участки). Весьма различная

22

электроотрицательность атомов пептидной группировки лежит в основе поляризации химических связей и способности атомов образовывать водородные связи.

Классификация и номенклатура пептидов

По числу аминокислотных остатков пептиды подразделяют на: 1) олигопептиды (ди-, три-, тетра-, пента-, гекса-, гепта-, ок- та-, нона- и декапептиды), если в пептид входит до 10 аминокислот; 2) полипептиды (10—50 аминокислот). А если число аминокислотных остатков в полипептидах > 50, такие соединения называют белки.

Используя значение средней молекулярной массы 20 кодируемых аминокислот, которое принято равным 120, можно легко рассчитать, что относительная молекулярная масса пептидов не превышает величины порядка 6000.

В настоящее время общепринятым является использование тривиальных названий важнейших природных пептидов. Согласно правилам номенклатуры, для полного названия пептида и записи его первичной структуры используют чередующиеся одноили трехбуквенные сокращенные обозначения тривиальных названий аминокислот. Аминокислоты в пептидах нумеруются с N-конца, который при записи располагают слева, а в названиях всех аминокислот, кроме С-концевой, окончание -ин (-ан) меняется на -ил.

Структурная изомерия пептидов может быть связана с изменением порядка чередования аминокислот в пептиде. Так, например, пептиды глицил-аланин и аланил-глицин при одинаковой брутто-формуле различаются по химической структуре и свойствам.

Глицил-L-аланин			L-аланин-глицил
	C3H10N3O3			C3H10N3O3
	O	CH3		O
H2N	N	COOH	H2N	N	COOH
	H			CH3 H

Большинство пептидов синтезируются на рибосомах в виде более крупных неактивных предшественников, которые затем подвергаются активации путем ограниченного поэтапного ферментативного расщепления (протеолиза) и удаления неактивных

23

участков. Многие пептиды (например, пептидные гормоны) микрогетерогенны и представлены в организме набором гомологич- ных форм, возникающих вследствие посттрансляционных модификаций одной первоначально синтезированной пептидной структуры. Родственные по первичной структуре пептиды объединяются в семейства пептидов. Многие пептиды, особенно регуляторные, разных видов организмов сравнительно мало отлича- ются по первичной структуре, т. е. весьма консервативны. Существенным отличием пептидов от белков является то, что небольшие пептиды (например, глутатион) могут синтезироваться в клетках нематричным способом, т. е. такие пептиды не имеют собственных генов, а синтезируются ферментативно непосредственно из аминокислот.

Биохимические свойства пептидов

Химические свойства пептидов имеют принципиальное сходство со свойствами белков, за исключением, по-видимому, тех свойств, которые рождены высокополимерной структурой белков. Свойства пептидов определяются индивидуальными особенностями их структурной организации, наличием функциональных групп в составе боковых радикалов аминокислот. Встречаются гидрофильные и гидрофобные пептиды. Значения изоэлектрических точек (рI) амфотерных пептидов строго индивидуальны. Стереоизомерия пептидов эффективно проявляется в реализации биологических свойств: как правило, любые замены аминокислот (в том числе замены L- на D-аминокислоты) чрезвычайно негативно сказываются на функциях пептидов. Многие пептиды можно получить в кристаллическом состоянии. Для анализа пептидов применимы все методы, которые используются для исследования белков.

Функции пептидов в биологических объектах разнообразны

èвключают:

регуляцию метаболических процессов (гормональная функция);

передачу нервных импульсов (нейромедиаторная и модуляторная функции);

защитную функцию.

Функции пептидов отнюдь не ограничены этим списком и будут детализированы в курсе лекций. Многие природные пептиды обладают высокой токсичностью. Это пептидные токсины бледной поганки (аманитины и фаллоидины), ядов змей, ос,

24

пчел и др. Пептиды входят в состав пептидогликанов (муреинов), т. е. углевод-пептидных полимеров, формирующих клеточ- ные стенки бактерий.

Структурно-функциональная организация пептидов

Тиреолиберин — один из гормонов гипоталамуса, который специфически активирует функцию гипофиза и в конечном итоге стимулирует гормональную функцию щитовидной железы. Это самый маленький по структуре регуляторный пептид, а его содержание в гипоталамусе столь ничтожно, что для полу- чения нескольких миллиграммов очищенного тиреолиберина понадобилось несколько тонн гипоталамусов животных. В 1977 г. за исследования пептидных гормонов мозга Р. Гиймен (Франция) и Э. В. Шалли (США) удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине. К особенностям структуры тиреолиберина относится наличие трех пятичленных азотсодержащих гетероциклов, присутствие остатка циклического производного глутаминовой кислоты, отсутствие свободных СООН- и NH2-концевых групп. Все эти модификации осуществляются ферментативно и придают специфическую конформацию молекуле тиреолиберина.

Глутатион — это один из наиболее распространенных пептидов в клетках, где его концентрация достигает необычайно высоких значений для пептидов (до нескольких мМ). В структуре глутатиона одна из пептидных связей образована остатком-СООН-группы (а не -СООН) глутаминовой кислоты.

Глутатион активно используется разнообразными клетками для переноса аминокислот в клетки. Глутатион входит в состав биологически активных лейкотриенов. Активным участком молекулы глутатиона является SH-группа, которая легко реагирует с электрофильными эндо- и экзогенными соединениями, в том

25

числе со свободнорадикальными продуктами окисления ксенобиотиков (чужеродных соединений).

Глутатион: L- -глутамил-L-цистеинил-глицин L- -Глу-L-Цис-Гли

	O		SH H
HOOC	N		N COOH
NH2
	H O
L- -Ãëó	L-Öèñ Ãëè

Таким образом, глутатион служит универсальным защитным пептидом клетки от токсического действия свободных радикалов. Глутатион эффективно предотвращает окисление SHгрупп, агрегацию белков хрусталика глаза и, следовательно, его помутнение при катаракте. Не случайно, что среди всех органов и тканей хрусталик занимает первое место по содержанию глутатиона (до 20 мМ!). Защитная функция глутатиона в отношении белков реализуется по схеме, где ГSH (GSH) — восстановленный глутатион, а ГSSГ (GSSG) — окисленный димер глутатиона:

Гормон окситоцин — нонапептид, синтезируемый клетками гипоталамуса, откуда он поступает в гипофиз, а затем секретируется в системный кровоток. Окситоцин специфически стимулирует сокращение гладких мышц матки и молочных желез.

В отличие от глутатиона, который активен в восстановленном состоянии, в биологически активной молекуле окситоцина SH-группы окислены и формируют особую циклическую пептидную структуру.

Инсулин — один из важнейших пептидных гормонов млекопитающих, который оказывает многогранное регуляторное действие практически на все типы клеток организма. Инсулин регу-

26

лирует метаболизм углеводов, обладает гипогликемическим действием, контролируя один из фундаментальных параметров гомеостаза — концентрацию глюкозы в крови. С инсулином непосредственно связаны события, по праву ставшие одними из клю- чевых пунктов в развитии не только биохимии и молекулярной биологии, но и всех биомедицинских наук. Еще в 1922 г. Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена канадским ученым Ф. Г. Бантингу и Дж. Р. Маклеод за открытие инсулина. К середине 50-х гг. прошлого века англичанин Фредерик Сенгер (F. Sanger) разработал динитрофторбензольный метод поэтапной химической модификации, кислотного отщепления и хроматографической идентификации окрашенных производных аминокислот по N-концу пептида. Этим методом Сенгер впервые установил полную первичную структуру полипептида — инсулина. За это достижение Сенгеру в 1958 г. присуждена Нобелевская премия по химии. Инсулин синтезируется в -клет- ках островков Лангерганса поджелудочной железы в виде неактивного проинсулина, содержащего 84 аминокислоты. Инсулин подвергается ферментативному ограниченному протеолизу (места протеолиза показаны на схеме стрелками, с. 28) с образованием неактивного С-пептида и инсулина. В результате из одной полипептидной цепи проинсулина формируется двуцепочечная молекула инсулина, состоящая из двух цепей — А-цепи (21 аминокислота) и В-цепи (30 аминокислот). Для проявления биологи- ческой активности обе цепи удерживаются двумя межцепочеч- ными и одной внутрицепочечной дисульфидными связями. Формирование полностью активной конформации инсулина завершается при участии ионов цинка.

Первичная структура инсулинов различных видов позвоноч- ных к настоящему времени установлена. Структура инсулинов человека и некоторых животных весьма консервативна — ами-

27

нокислотные замены наблюдаются только по положениям 8, 9, 10 в А-цепи и по положению 30 В-цепи (табл. 2). Инсулин свиньи ближе всех по первичной структуре к инсулину человека, что имеет огромное практическое значение для промышленного производства фармацевтического инсулина и использования в качестве лекарственного препарата.

Таблица 2

Особенности первичной структуры А- и В-цепей инсулинов Mammalia

Âèä		À-öåïü		Â-öåïü
Человек	Òðå-8	Ñåð-9	Èëå-10	Òðå-30
Свинья	Òðå-8	Ñåð-9	Èëå-10	Àëà-30
Корова	Àëà-8	Ñåð-9	Âàë-10	Àëà-30
Îâöà	Àëà-8	Ãëè-9	Âàë-10	Àëà-30
Лошадь	Òðå-8	Ãëè-9	Èëå-10	Àëà-30

Пептиды в отличие от белков не обладают каталитическими (ферментативными) свойствами. В силу ряда ограничений пептидам попросту не хватает молекулярных размеров для формирования активных каталитических центров и активации достаточно сложных и крупных органических соединений. Некоторые исключения из этого правила относятся к продуктам неполного протеолиза активных ферментов и, по-видимому, не имеют принципиального функционального значения для клеток.

28

Ñисторией изучения пептидов связаны такие знаменательные события, как реализация давней мечты химиков — полный химический синтез пептидов и белков. Несмотря на то, что первые простейшие пептиды были синтезированы в конце XVIII — начале XIX в. Т. Курциусом и Э. Фишером, только в начале 50-х гг. прошлого века В. Дю Виньо (США) впервые химически синтезировал пептидный гормон окситоцин, за что в 1955 г. ему была присуждена Нобелевская премия по химии. Позднее под руководством Р. Б. Мэррифилда (США) разработаны методы твердофазного химического синтеза, что позволило синтезировать не только пептиды, но и ряд более крупных белков и ферментов. В 1984 г. Мэррифилд удостоен за эти работы Нобелевской премии по химии.

Ñтех пор разработаны высокоэффективные методы препаративного твердофазного химического синтеза пептидов с использованием автоматических пептидных синтезаторов. Таким образом, проблема химического синтеза пептидов успешно решена. Вместе с тем ряд уникальных пептидов по-прежнему получают из природного сырья. В настоящее время наиболее перспективны эффективные биотехнологические методы получения генноинженерных пептидов с помощью микробных суперпродуцентов. Масштабы общемирового производства такого пептида, как инсулин, достигают десятков тонн в год! Пептиды широко используются в качестве пищевых, биологически активных и кормовых добавок, лекарственных, ветеринарных и диагностиче- ских средств и др.

БЕЛКИ

Белки, или протеины, — это высокомолекулярные линейные, нерегулярные, неразветвленные природные полимеры, построенные из -аминокислот, соединенных пептидными связями. Термин «протеин» ввел Мульдер по предложению Берцелиуса еще в XIX в. С тех пор достигнуты фантастические успехи в биохимии белков, которая представляет собой один из самых сложных и интересных разделов современных естественных наук. Мнение исследователей конца XIX в. о том, что белки составляют основу жизненных процессов, не только не пошатнулось, но, напротив, с тех пор еще более укрепилось. В те далекие годы по-настоящему началась история биохимии белков, и уже в 1910 г. А. Коссель (Германия) был удостоен Нобелевской премии за исследования по химии белков. Важная веха в развитии биохимии белков связана с получением высокоочищенных кристаллических белков. В 1946 г. Нобелевская премия была присуждена Дж. Б. Самнеру (США) за первое получение фермента (уреазы) в кристаллическом виде, а также У. М. Стэнли и Дж. Нортропу (США) за получение в кристаллическом виде ряда ферментов и вирусов. Позднее Ф. Сенгеру за разработку метода анализа первичной структуры белков и установление полной первичной структуры полипептида в 1958 г. присуждена Нобелевская премия. В 1972 г. Нобелевской премией отмечены работы Р. Р. Портера (Великобритания) и Дж. М. Эдельмана (США) за установление химической структуры иммуноглобулинов — по структуре весьма сложных белков. Под руководством лауреата Нобелевской премии 1984 г. Мэррифилда (США) разработаны методы твердофазного химического синтеза, что позволило синтезировать фермент рибонуклеазу (124 аминокислоты), хотя эффективность этой процедуры была не очень впечатляющая — выход около 18 % при скорости синтеза, равной одной пептидной связи за 3 часа химических реакций. В настоящее время на основе твердофазного химического синтеза созданы автоматизированные пептидные синтезаторы, эффективность работы которых

30

несравненно выше. Этот далеко не полный перечень наиболее важных событий в области биохимии белков тем не менее убедительно свидетельствует о первостепенном внимании, которое исследователи уделяют белкам.

Белки могут состоять из одной или нескольких полипептидных цепей, связанных между собой как ковалентно, так и нековалентно. В состав белков входят 20 генетически кодируемых аминокислот. Вместе с тем во многих белках обнаруживается не менее 50 минорных аминокислот, которые чаще всего образуются в результате биохимических модификаций обычных аминокислот (посттрансляционная ковалентная биохимическая модификация белков). Структура белков генетически кодируется, а биосинтез белков реализуется матричным способом. Белки составляют основную часть сухого вещества клеток животных, бактерий и вирусных частиц. Например, на белки приходится в среднем около 45 % сухого вещества тела человека. Вместе с тем относительное содержание белка в различных органах и тканях значительно варьирует — от 24—28 % в зубах и костях до 80—84 % в селезенке и мышцах. В среднем можно считать, что белки составляют около 10 % биомассы на Земле.

Âрастениях доминируют полисахариды и содержание белка

âцелом ниже, чем у животных, достигая 35 % только в запасающих тканях семян зерновых культур. Животные белки характеризуются существенно более полноценным для питания аминокислотным составом, чем белки растений.

Концентрация белков в ряде случаев может достигать очень высоких значений — содержание тиреоглобулина в полости фолликула щитовидной железы, гемоглобина в эритроцитах, актомиозина в мышцах порой доходит до максимального предела — около 500—800 г/л!

Белки присутствуют во всех компартментах клеток и во внеклеточной среде. Обычно специфическая локализация белков индивидуальна. С регулируемым изменением расположения белка связан один из способов регуляции функциональных свойств.

Белки, даже таксономически очень отдаленных видов, обнаруживают сходство элементного состава. В среднем углерод составляет около 54 %, кислород ~ 22 %, азот ~ 15 % (наиболее постоянен), водород ~ 7 %, сера ~ 0,5 %. В составе некоторых белков обнаруживаются обычно в небольших количествах Р, Ca, Mg, Na, K, Fe, Zn, Cu, Co, Mo, Mn, W, Cr, Ni, V, Se, I, Cl и др. Ме-

31