senchuk_v_v_biohimiya_kurs_lekcii

биохимических механизмов, регулирующих тканеспецифич- ность экспрессии белков. Кроме этого экспрессия белков зачастую существенно меняется в зависимости от дифференцировоч- ного и пролиферативного статуса клетки. Например, для ряда белков существуют особые эмбриональные и взрослые изоформы белков.

В настоящее время установлено, что в первичной структуре часть аминокислот относится к вариабельным (нейтральным), т. е. замена их на другие аминокислоты не сильно сказывается на биологических свойствах. И есть инвариантные (консервативные) — их замена радикально изменяет функциональные свойства белков и пептидов. Для каждого белка инвариантные и вариабельные аминокислоты строго специфичны. Замена аминокислот в белках является следствием одного из типов генных мутаций. К консервативным белкам относятся те, которые мало изменились в процессе эволюции. Большинство консервативных белков возникло очень рано и, как правило, выполняет очень важные функции. Пример — цитохром ñ (104 аминокислоты): человек и приматы отличаются по одной аминокислоте, человек и собака — по 10 аминокислотам, от дрожжей человек отличается по 40 аминокислотам, что оценивается как высокая степень гомологии первичной структуры (> 40 %). Не менее 150 наследственных заболеваний человека в основе своей связаны с экспрессией мутантных форм белков. Мутантные формы онкобелков лежат в основе некоторых злокачественных заболеваний че- ловека. Сравнительно недавно М. Смитом (Канада) был разработан метод направленного мутагенеза белков и применен для установления структуры белков. Эта работа по праву отмечена в 1993 г. Нобелевской премией, так как метод позволяет целенаправленно по желанию экспериментатора изменять аминокислоты в любом месте полипептидной цепи. Таким образом, метод направленного мутагенеза в настоящее время является одним из наиболее важных и перспективных технологий в биохимии белка и в белковой инженерии.

Вторичная структура белков представлена двумя типами:-спираль è -структура (èëè -складчатый ñëîé).

В начале XX в. Брэгг разработал теорию рентгеноструктурного анализа, в 30-х гг. Астбюри впервые получил качественные результаты рентгеноструктурного анализа белков, в 40— 50-е гг. существование -спирали и -структуры в белках дока-

42

зано экспериментально, а в 1954 г. Л. К. Полингу (США) присуждена Нобелевская премия за исследование природы хими- ческой связи.

-Спираль — это правозакрученная полипептидная цепь, стабилизированная водородными связями (рис. 1). Водородные связи образуются между атомами, входящими в состав пептидных связей. -Спирали — жесткие компактные структуры, что достигается за счет многочисленных водородных связей. Каждая такая связь формируется между аминокислотами, которые расположены на соседних витках спирали, расстояние между ними приблизительно 3,6 аминокислоты.

Пролин и оксипролин вносят возмущения в -спи- раль, нарушая ее регулярность.

-Структура. Возникает при многократных изгибах полипептидной цепи, удерживаемых за счет водородных связей между атомами, входящими в состав пептидных связей (рис. 2). Изгибы возникают в местах расположения в полипептидной цепи остатков глицина и пролина. В белках существуют -структуры параллельного и антипараллельного типов. Во всех случаях боковые радикалы аминокислот экспонированы перпендикулярно к плоскости этого -складчатого слоя. У большинства нативных белков существует строго определенный баланс между -спи- ральными участками и -структурой. Существенные изменения вторичной структуры белков, как правило, сопряжены с их инактивацией. В некоторых случаях белок может быть построен в основном из одного типа вторичной структуры. Так, например, белок волос кератин и фиброин шелка почти на 100 % упакованы в виде -структуры, а главные белки белой соединительной ткани коллагены — почти на 100 % из -спиралей. Следует отметить, что коллагены — это самые распространенные белки организма человека и многих животных, составляю-

Ðèñ. 1. Схематическое изображение -спирали вторичной структуры белков (пунктирными линиями показаны водородные связи между атомами пептидных группировок)

43

COOH

COOH

H2N

H2N

Ðèñ. 2. Схематическое изображение -структуры белков антипараллельного и параллельного типов (пунктирными линиями показаны водородные

связи между атомами пептидных группировок)

щие 25—33 % от общего количества белка или около 6 % массы тела и до 95 % органического матрикса костей. Коллагены обогащены глицином (до 30 %), пролином и гидроксипролином (до 21 %), аланином (до 11 %) и практически нерастворимы в водной среде. Чрезвычайная прочность коллагенов, превышающая прочность стального троса аналогичных размеров, обеспечивается за счет формирования тройной спирали (фибриллы) из трех взаимно закрученных фибриллярных молекул -спирализован- ного коллагена! Стабильность коллагеновых фибрилл существенно увеличивается после посттрансляционного гидроксилирования остатков L-Лиз и L-Про при участии витамина С. В результате остатки гидроксипролина образуют многочисленные межмолекулярные водородные связи и, реагируя с остатками лизина, формируют межцепочечные ковалентные связи. К этому можно добавить дисульфидные межмолекулярные мостики за счет остатков цистеина. В результате коллагеновые связки ахиллова сухожилия способны выдерживать гигантские механиче- ские нагрузки. Эластин, важнейший белок желтой соединительной ткани, резко отличается от коллагена по первичной структуре и по способу организации. Нативные волокна эластина построены из относительно небольших глобулярных молекул, соединенных друг с другом жесткими поперечными ковалентными связями через остатки лизина. Тем самым создаются существенно более эластичные, резиноподобные волокнистые тяжи.

Третичная структура — способ укладки полипептидной цепи в пространстве. Впервые белковая третичная структура была установлена Дж. К. Кендрю и М. Ф. Перутцом (Великобритания) для глобулярных белков гемоглобина лошади и миоглобина ка-

44

шалота методом рентгеноструктурного анализа (Нобелевская премия 1962 г.).

Для определения третичной структуры используют высокоразрешающий рентгеноструктурный анализ и компьютерное моделирование, которые позволяют построить атомарную структуру белка. Для этого необходимо получить сверхочищенный белок в кристаллическом состоянии. Сейчас возможно достаточно эффективное моделирование и прогноз третичной структуры белков и пептидов на основании знания первичной структуры и сравнительного анализа с известными структурами по белковым базам данных.

В третичных 3D-структурах белков -спиральные участки и-структуры принято изображать в виде ленточных, цилиндри- ческих, спиральных форм.

В третичной структуре у белков появляются функциональные свойства. Третичная структура формируется самопроизвольно, но при решающем участии ряда вспомогательных факторов, и определяется первичной структурой. Нативная конформация различных белков уникальна, строго индивидуальна и реализуется в процессе функционирования белка в виде ограниченного числа взаимопревращаемых близких вариантов (конформеров). Третичная структура стабилизируется различными связями:

ковалентными дисульфидными связями между цистеинами;

нековалентными — водородными, гидрофобными и ионными связями между боковыми радикалами аминокислот.

Третичная структура может быть представлена в виде глобул и фибрилл. В большинстве случаев внутри глобулы локализованы гидрофобные аминокислоты, на поверхности водорастворимых белков находятся заряженные или полярные аминокислоты (рис. 3). В мембранных белках на некоторых участках их поверхности концентрируются гидрофобные аминокислоты, а на других, экспонированных наружу или внутрь клетки, заряженные или полярные. Молекула белка почти всегда гидратирована, поэтому связывает большое количество воды. Считается, что и в кристаллическом состоянии белки содержат связанную воду, однако внутри нативной белковой молекулы содержание воды обычно невелико.

Доменная структура белков. Это промежуточный тип организации между вторичной и третичной структурой белков (рис. 4). Домен представляет собой структурно обособленный

45

Ðèñ. 3. Схема организации гидрофильных (А) и гидрофобных (Б) белков

участок полипептидной цепи (модуль белка). Домены ведут себя сравнительно независимо, и изменения относительного расположения доменов относятся к крупным структурным перестройкам в белке. Часто в доменах локализованы определенные функциональные участки белка, и, следовательно, перемещение доменов друг относительно друга реализует каталитические и

Линейный

участок

-структура

-спираль

домен 1 домен 2

Ðèñ. 4. Схема доменной организации белков

46

иные функции белков. Домены имеют важный эволюционный смысл, так как показано, что появление новых белков может быть связано с комбинацией фрагментов ДНК, кодирующих различные типы доменов. Существование доменов хорошо идентифицируется методом микрокалориметрии, где, регистрируя изменение теплопоглощения белка при повышении температуры, можно увидеть поэтапное «плавление» белка через ряд фиксированных состояний, отражающих структурные изменения относительно независимых доменов. Кроме этого, белок можно разрезать на смесь доменов с помощью ограниченного гидролиза протеазами по междоменным пептидным связям, а индивидуальные домены можно затем очистить хроматографией для изу- чения их свойств.

Четвертичная структура представляет собой способ укладки в пространстве нескольких полипептидных цепей, обладающих третичной структурой и связанных друг с другом в виде единого макромолекулярного белкового комплекса. Молекулярная масса таких белков может достигать сотен тысяч и даже миллионов Да. Такие белки называются субъединичными белками. В их составе могут объединяться как несколько одинаковых субъединиц, так и несколько различных субъединиц — продуктов разных генов. Связи между субъединицами либо ковалентные (дисульфидные мостики), либо нековалентные. Появление четвертичной структуры в белках коррелирует с усложнением уровня развития живых объектов. Оно приводит к увеличению эффективности функционирования белков, к появлению регуляторных центров в белках и, следовательно, к совершенствованию механизмов регуляции активности белков, а также дает возможность комбинировать несколько различных функциональных центров в одной белковой молекуле. Таким образом, усложняясь, белки становятся не только «умнее», но и «сильнее». При анализе сложных белков будут рассмотрены как примеры белков природного происхождения, так и искусственно полученных химерных белков.

Сходным способом формируется структура и функциональные возможности надмолекулярных комплексов, которые, по сути, представляют собой переходный уровень организации биосистем между молекулярным и субклеточным. Надмолекулярные комплексы стабилизируются нековалентными связями. Как правило, организация таких комплексов очень динамична, а со-

47

отношение процессов ассоциации и диссоциации компонентов комплексов подвержено тонкой регуляции внеклеточными сигналами и внутриклеточными факторами. К таким надмолекулярным комплексам относится цитоскелет, метаболоны, рибосомы, нуклеопротеины и др. Встречаются и существенно более жесткие конструкции надмолекулярных комплексов — например, от плотноструктурированных комплексов сократительного аппарата мышц до квазикристаллических вирусных частиц. Комплексы могут состоять из многократно повторяющихся одинаковых частей (вирусные частицы; компоненты цитоскелета — актиновые микрофиламенты и тубулиновые микротрубочки). Также встречаются комплексы, построенные из различных белков (рибосомы, метаболоны и др.). Очень сложно устроен надмолекулярный комплекс, который осуществляет окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты, так называемый пируватдегидрогеназный мультиферментный комплекс. Он состоит из 100 молекул трех различных ферментов и пяти коферментов (тиаминпирофосфат, липоевая кислота, кофермент А, ФАД и НАД+)!

На уровне третичной и четвертичной структуры в белках появляются активные и регуляторные центры, контактные участки, которые могут быть организованы в виде впячиваний, щелей и карманов, выстланные боковыми радикалами определенных аминокислот. Причем сходные функции обеспечиваются близкими по структуре функциональными центрами. Например, АТФ-связывающий центр с высокой степенью вероятности имеет одинаковую или близкую организацию у разных АТФ-связы- вающих белков. Вся остальная часть белковой молекулы, размеры которой значительно превосходят размеры функциональных центров, служит для организации, активации и поддержания дееспособности таких активных центров. Высокоточная стереоспецифическая организация функциональных центров является обязательным условием эффективного функционирования белков. Общебиологическое значение этих знаний отмечено присуждением в 1972 г. Нобелевской премии К. Б. Анфинсену, С. Муру и У. Х. Стайну (США) за изучение молекулярной структуры фермента рибонуклеазы и ее связи с каталитической активностью, хотя с тех пор представления об организации и механизмах функционирования белков существенно расширились

48

и углубились. Правильное взаимодействие достигается за счет электростатической и геометрической комплементарности определенных химических структур в комплексах: белок-белок, бе- лок-субстрат, белок-кофактор, белок-регулятор. Более того, при этом должно реализовываться так называемое индуцированное соответствие между участниками комплекса, т. е. непосредственно в процессе взаимодействия осуществляется их взаимное влияние, создающее наилучшие условия для связывания. Так работают ферменты и белки без каталитической функции.

В заключение можно привести общую схему организации химических связей, стабилизирующих структуру белков (рис. 5). Полипептидная цепь организована: 1) ковалентными пептидными связями; 2) пространственная структура формируется за счет водородных связей между С=О и N-H группами пептидных связей; фенольным кольцом L-Тир и СООН-группой L-Асп или L-Глу; 3) ионными связями между кислыми и основными аминокислотами (например, между L-Лиз и L-Глу, L-Арг и L-Асп); 4) ковалентными дисульфидными мостиками между двумя остатками цистеина; 5) гидрофобными взаимодействиями между ароматическими ядрами или алифатическими радикалами (на схеме все эти типы связей расположены в направлении слева направо).

Таким образом, с увеличением сложности структурной организации белка не только развиваются структурно-функциональ- ные и регуляторные свойства белков, но и происходит компактизация белковой молекулы, что позволяет эффективно наполнить

Ðèñ. 5. Схема организации связей, стабилизирующих структуру белков

49

содержимое клеток многочисленными молекулами разнообразных белков.

Денатурация и ренатурация белков

Денатурация — это потеря специфической конформации и биологических свойств. Белки денатурируют под действием кислот, щелочей, органических растворителей, нагревания, электромагнитного излучения и др. Для денатурации большинства белков достаточно, например, нагревания выше 50 С, замораживания, рН < 4 и > 9, и др. При этом происходит разрушение в большинстве своем слабых, хотя и многочисленных, нековалентных связей, стабилизирующих конформацию белков. Лишь в исключительных случаях белки активны при рН около 1,0 (пепсин желудка) или выдерживают нагревание до температур 90—100 С (лизоцим, белки термофильных микроорганизмов). Существует обратимая и необратимая денатурация. Эффективность обратного процесса — ренатурации — в значительной степени зависит от глубины денатурации. Существуют антиденатуранты (полиолы сахароза, глицерин; субстраты и кофакторы белков), которые ограничивают подвижность структуры белковой молекулы, стабилизируют организацию функциональных центров или непосредственно взаимодействуют с денатурирующим фактором и подавляют его активность. Исследования реакций денатурации и ренатурации белков важны для понимания конформации белков, механизмов фолдинга, механизмов функционирования белков. Практическое применение этих знаний реализуется в инженерной энзимологии и биотехнологии, использующих ферменты в производстве необходимых соедине-

50

ний. Реакции денатурации постоянно сопровождают жизнь белков в живых системах. Среднее время жизни белков в организме человека составляет около двух суток. Реакции образования и распада белков на аминокислоты регулируются потребностями клетки. Эта величина индивидуальна для каждого белка и варьирует от нескольких минут до нескольких лет. Причины запуска реакций деградации белков не вполне понятны. Одной из них является самоинактивация ферментов в процессе выполнения каталитической функции. При этом происходят изменения конформации белков, и эти изменения распознаются специальным внутриклеточным белком убиквитином, который при использовании АТФ формирует ковалентный комплекс с инактивированным белком. Этот комплекс запускает реакцию глубокого расщепления белка протеолитическими ферментами. Кроме этого, существует специальный механизм запуска реакций деградации гликопротеинов плазмы крови, который связан с модификацией углеводного компонента, что является сигналом к утилизации такого белка.

Биохимия гетеромерных белков

Большинство белков биосистем относится к гетеромерным. Распространение, разнообразие и сложность строения гетеромерных белков возрастает с усложнением уровня биологической организации. В состав гетеромерных (или сложных) белков входят и неаминокислотные компоненты, которые могут быть связаны с полипептидной цепью как ковалентно, так и нековалентно.

На основании строения небелкового компонента сложные белки делят на следующие основные группы:

хромопротеины;

нуклеопротеины;

металлопротеины;

липопротеины;

фосфопротеины;

гликопротеины.

Обычно небелковые компоненты принимают самое непосредственное участие в функционировании сложного белка. В этом случае небелковую часть именуют как простетическая группа, кофермент èëè кофактор. В некоторых белках одновременно присутствует несколько различных кофакторов. Такие белки, как правило, относятся к полифункциональным ферментам.

51