senchuk_v_v_biohimiya_kurs_lekcii

рин) из чая и кофе и др. Азотистое основание гипоксантин (6-ок- сопурин) формирует нуклеозид инозин и входит в состав инозинмонофосфорной кислоты, которая синтезируется de novo по единой схеме от бактерий до человека и является предшественником всех других пуриновых нуклеотидов. Однако главным образом азотистые основания формируют структуру более сложных соединений — нуклеозидов и нуклеотидов.

НУКЛЕОЗИДЫ

Строение, классификация и номенклатура нуклеозидов

Нуклеозид — это соединение гетероциклического азотистого основания с моносахаридом, связанные друг с другом через атомы С и N гликозидной связью. В биообъектах встречаются пуриновые и пиримидиновые нуклеозиды. Правила нумерации атомов и названия азотистых оснований по ИЮПАК показаны на рис. 14—15 и в табл. 3.

Ðèñ. 14. Строение рибозы и дезоксирибозы

Они предполагают различную нумерацию атомов в азотистом основании и в остатке моносахарида — к номерам С-атомов добавляют знак ‘. Наиболее распространенные моносахариды в составе природных нуклеозидов — D-рибоза и 2-дезокси-D-рибо- за в фуранозной форме.

В связи с этим существуют не только нуклеозиды, но и дезоксинуклеозиды. Основные (или канонические) нуклеозиды представлены в табл. 3. В структуре пуриновых нуклеозидов остаток моносахарида связан с азотистым основанием N9-глико- зидной связью, а в пиримидиновых — N1-гликозидной связью. Все природные нуклеозиды имеют -конфигурацию N-гликозид-

72

Ðèñ. 15. Строение нуклеозидов

ной связи. Пиримидины характеризуются более стабильной àí- òè-ориентацией, т. е. атом кислорода при С-2 направлен в сторону от остатка моносахарида. У пуринов существуют как àíòè-, òàê è ñèí-конформеры (у гуанозина — только ñèí). Ñèí-ориента- ция предполагает поворот остатка азотистого основания в сторону сахара вокруг оси N-гликозидной связи.

Âбольшинстве эукариотических клеток биохимические процессы организованы таким образом, что только нуклеотиды являются продуктами биосинтеза, а нуклеозиды и азотистые основания образуются в результате биохимических превращений нуклеотидов.

Âклетках и во внеклеточной среде организмов нуклеозиды обнаруживаются в свободном состоянии, но распределены неравномерно. Например, аденозин присутствует в плазме крови в концентрациях на 2—3 порядка ниже, чем внутри клеток, выполняя роль компонента пуринэргической регуляторной системы организма.

Минорные нуклеозиды, т. е. производные основных нуклеозидов, встречаются в клетках главным образом в составе нуклеиновых кислот. В тРНК эукариотов они составляют до 25 % нуклеозидного состава, в ДНК растений — до 10 %, в ДНК позвоноч-

73

ных — до 2 % у взрослых и до 8 % в эмбрионах, в рРНК — до 2 %, в ДНК насекомых — лишь в следовых количествах. Наибольшее содержание минорных нуклеозидов характерно для специальных участков ДНК — так называемых многократных повторов.

Часто встречаются метилированные минорные нуклеозиды — продукты ферментативного О-, С- или N-метилирования азотистых оснований и остатков моносахарида, которое происходит непосредственно на молекуле ДНК или РНК с использованием донора метильных групп S-аденозилметионина (тоже нуклеозид!). Такое метилирование высокоспецифично к определенным участкам в нуклеиновых кислотах и участвует в формировании специфической структуры нуклеиновых кислот, в регуляции экспрессии генов и др. Интересно, что тимин (азотистое основание ДНК) является продуктом реакции метилирования урацила (азотистого основания в РНК). Некоторые важные минорные нуклеозиды не являются продуктами реакции метилирования. Так, например, 5,6-дигидроуридин (hU) и 5-рибозилурацил (псевдоуридин, ) принимают участие в структурно-функцио- нальной организации тРНК.

Среди минорных нуклеозидов особое значение принадлежит 8-гидроксидезоксигуанозину, который является продуктом неферментативного гидроксилирования остатков дезоксигуанозина в ДНК под действием мощнейшего эндогенного мутагена — ОН-радикала. Поэтому содержание 8-гидроксидезоксигуанозина характеризует интенсивность протекания в клетках неблагоприятных процессов повреждений ДНК и возникновения нежелательных мутаций.

Необычные природные нуклеозиды некоторых морских губок, где вместо рибозы присутствует арабиноза, являются родоначальниками современных противовирусных и противораковых препаратов.

Природные нуклеозиды получают ферментативным гидролизом ДНК или щелочным гидролизом РНК с последующим ферментативным дефосфорилированием полученных нуклеотидов. Смесь нуклеозидов разделяют хроматографически на индивидуальные соединения. Разработаны эффективные методы химического синтеза нуклеозидов. Нуклеозиды могут быть получе- ны в виде бесцветных кристаллических веществ. Растворы нуклеозидов характеризуются максимумом поглощения вблизи 260 нм. Основные и необычные природные, а также химически модифицированные нуклеозиды широко применяются в медици-

74

не для лечения вирусных, злокачественных и других заболеваний человека.

НУКЛЕОТИДЫ

Строение, классификация и номенклатура нуклеотидов

Нуклеотиды (нуклеозидфосфаты) — это фосфорные эфиры нуклеозидов обычно по 3’- и 5’-ОН группам остатка моносахарида. Большинство природных нуклеотидов имеют -конфигура- цию N-гликозидной связи. В живых объектах встречаются мо- но-, ди-, три- (реже тетра- и поли-) фосфопроизводные нуклеозидов. Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды представлены в виде рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов. Основные представители нуклеотидов перечислены в табл. 3, а принцип строения показан на рис. 16. Поскольку нуклеотиды могут реагировать друг с другом, их классифицируют по числу структурных мономеров на мононуклеотиды, олигонуклеотиды (ди-, три-, тетра- и т. д.) и полинуклеотиды. В природных мононуклеотидах доминирует 5’-фосфоэфирная связь, как показано на рис. 16. Причем такое общеизвестное соединение, как АТФ, обычно реализует свою биологическую активность в виде координационного комплекса с ионом магния. К числу важнейших полинуклеотидов относят ДНК и РНК.

При физиологических значениях рН среды нуклеотиды заряжены отрицательно, причем величина заряда на единицу больше числа фосфатных остатков в молекуле. Нуклеотиды обладают меньшей конформационной подвижностью, чем нуклеозиды. Фосфатная группа может отщепляться ферментами фосфатазами. Нуклеотиды — это мономерные звенья и промежуточ- ные продукты реакций биосинтеза нуклеиновых кислот и нуклеотидных коферментов, биоактивированные формы аминокислот (аминоациладенилаты, аминоацил-тРНК), олиго- и полисахаридов (нуклеозидфосфаты сахаров, например уридиндифосфатглюкоза), углеводных компонентов гликопротеинов (долихолфосфатсахара), компонентов фосфолипидов (цитидиндифосфатхолин) и др. Для построения нуклеиновых кислот, коферментов и большинства других соединений используются только 5’-фос- фопроизводные нуклеозидов. Иногда встречаются 2’-фосфопро- изводные — продукты распада нуклеиновых кислот. Особую группу нуклеотидов составляют так называемые цикличе-

75

Ðèñ. 16. Строение адениловых нуклеотидов

ские нуклеотиды (3’,5’-цАМФ и 3’,5’-цГМФ) — универсальные регуляторы метаболизма. Под действием гормонов и других внеклеточных регуляторов в клетках животных циклические нуклеотиды образуются в очень низких концентрациях (меньше 10–7 М) из АТФ и ГТФ ферментами аденилатциклазой и гуанилатциклазой соответственно. Для сравнения концентрация обычных метаболитов в клетках и во внеклеточ- ной среде находится в диапазоне 10–5—10–3 М. Однако даже в таких ничтожных концентрациях цикли- ческие нуклеотиды способны вклю- чать АТФ-зависимое обратимое фосфорилирование внутриклеточных белков и в тысячи раз активировать

76

Таблица 3

Природные азотистые основания, нуклеозиды и нуклеотиды

	Азотистые	Нуклеозиды	Нуклеотиды
	основания
		Пуриновые
	Семейство	Аденозин (9- -D-	Аденозин-5’-монофосфат (АМФ; АMP)
	аденина	рибофуранозил-аде-
			Аденозин-5’-дифосфат (AДФ; ADP)
	Аденин
		íèí; À)
	(6-амино-		Аденозин-5’-трифосфат (AТФ; ATP)
	пурин)
			Циклическая 3’,5’-аденозинмонофос-
			форная кислота (3’,5’-цАМФ; сАМР)
		2-дезокси-Аденозин	äÀÌÔ (dÀMP); äÀÄÔ (dÀDP);
		(9- -D-2’-дезокси-	äÀÒÔ (dÀTP)
		рибофуранозил-аде-
		íèí; äÀ, dA)
	Семейство	Гуанозин (9- -D-ри-	Гуанозин-5’-монофосфат (ГМФ; GMP)
	гуанина	бофуранозил-гуа-
			Гуанозин-5’-дифосфат (ГДФ; GDP)
	Гуанин	íèí; Ã, G)
	(2-амино-		Гуанозин-5’-трифосфат (ГТФ; GTP)
	6-оксопурин)
			Циклическая 3’,5’-гуанозинмонофосфор-
			ная кислота (3’,5’-цГМФ; 3’,5’-сGМР)
		2-дезокси-Гуанозин	äÃÌÔ (dGMP); äÃÄÔ (dGDP)
		(9- -D-2’-дезокси-
			äÃÒÔ (dGTP)
		рибофуранозил-гуа-
		íèí; äÃ; dG)
	Семейство	Инозин (9- -D-ри-	Инозин-5’-монофосфат (ИМФ; IMP)
	гипоксан-	бофуранозил-гипо-
			Инозин-5’-дифосфат (ИДФ; IDP)
	òèíà
		ксантин)
	Гипоксантин		Инозин-5’-трифосфат (ИТФ; ITP)
	(6-гидрокси-
	пурин)
		Пиримидиновые
	Семейство	Тимидин (рибозил-	Тимидин-5’-монофосфат (дТМФ; dТMP)
	тимина	тимин, 3- -D-2’-де-
			Тимидин-5’-дифосфат (дТДФ; dТMP)
	Тимин (5-ме-
		зоксирибофурано-
	тилурацил)	зил-тимин; Т)	Тимидин-5’-трифосфат (дТТФ; dТTP)
	Семейство	Уридин (3- -D-ри-	Уридин-5’-монофосфат (УМФ; UMP)
	урацила	бофуранозил-ура-
			Уридин-5’-дифосфат (УДФ; UDP)
	Урацил	öèë; Ó, U)
	(2,4-диоксо-		Уридин-5’-трифосфат (УТФ; UTP)
	пиримидин)
	Семейство	Цитидин (3- -D-ри-	Цитидин-5’-монофосфат (ЦМФ; СMP)
	цитозина	бофуранозил-цито-	Цитидин-5’-дифосфат (ЦДФ; СDP)
	Цитозин
		çèí; Ñ)
	(2-îêñî-4-		Цитидин-5’-трифосфат (ЦТФ; СTP)
	аминопири-
			äÖÌÔ (dÑMP); äÖÄÔ (dÑDP);
	мидин)
			äÖÒÔ (dÑTP)

77

разнообразные биохимические реакции. Регуляторное действие циклических нуклеотидов строго контролируется и ограничивается путем их разрушения ферментами фосфодиэстеразами. Таким образом, циклические нуклеотиды (3’,5’-цАМФ и 3’,5’-цГМФ) вовлечены в регуляцию метаболизма в качестве вторичных посредников или мессенджеров, осуществляющих перевод внеклеточных регуляторных сигналов на «язык» клетки. В бактериях 3’,5’-цАМФ также выполняет роль внутриклеточного регулятора метаболизма. Но в этом случае 3’,5’-цАМФ используется по-другому — он регулирует транскрипцию генов.

Все прокариоты и эукариоты располагают особыми ферментативными системами как биосинтеза нуклеотидов de novo, так и их разрушения. Причем не существует отдельного пути биосинтеза дезоксинуклеотидов, а они являются продуктами биохимического преобразования готовых нуклеотидов.

В водных растворах азотистые основания нуклеотидов подвергаются таутомерии. Основная таутомерная форма азотистых оснований — лактàмная форма:

Появление лактèмной формы азотистых оснований в составе ДНК влечет невозможность правильного спаривания азотистых оснований разных нитей ДНК в процессе репликации и, следовательно, может привести к мутации. Изредка встречаются минорные нуклеозиды — продукты О-, С- или N-алкилирования азотистых оснований, а также продукты алкилирования ОН-групп остатков моносахарида.

В заключение можно выделить основные функции нуклеозидов и нуклеотидов в живых системах:

1.Энергетическая функция: в основном нуклеозидäèфосфаты и нуклеозидòðèфосфаты (но не их дезоксипроизводные и не нуклеозидìîíîфосфаты) относятся к биологически значимым макроэргическим соединениям.

2.Коферментная функция, которая реализуется путем участия в составе ферментов таких нуклеотидных коферментов, как флавинадениндинуклеотид (ФАД), флавинмоно-

78

нуклеотид (ФМН), коэнзим А, никотинамидные коферменты.

3.Регуляторная функция: внутриклеточные регуляторы 3’,5’- цАМФ и 3’,5’-цГМФ; внеклеточные регуляторы — соединения пуринэргической системы; цитокининовые производные аденина являются фитогормонами.

4.Функция переноса химических групп в биохимических реакциях в биосинтезе углеводов, некоторых липидов и др.

5.Нуклеотиды и нуклеозиды входят в состав ряда витаминов, антибиотиков, различных биологически активных соединений.

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Нуклеиновые кислоты открыл швейцарец Ф. Мишер в 1868 г., а в 1889 г. появился термин «нуклеиновые кислоты» (от лат. nucleus — ядро). Однако лишь в 1944 г. О. Эвери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти (США) впервые привели полноценные экспериментальные доказательства генетической роли ДНК у бактерий. А после того как через 5 лет Г. Рис и А. Мирский доказали генетическую роль ДНК в клетках высших организмов, началось бурное развитие биохимии нуклеиновых кислот и открылась новая эпоха в биологии.

Нуклеиновые кислоты — это полинуклеотиды, полианионы, неразветвленные и нерегулярные, исключительно крупные биополимеры. Существуют линейные и замкнутые (кольцевые), одноцепочечные и двуцепочечные полинуклеотиды. По особенностям химического строения нуклеиновые кислоты делят на дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) и рибонуклеиновые кислоты (РНК). Есть несколько типов ДНК: хромосомная (ядерная, нуклеоидная) и внехромосомная (митохондриальная, хлоропластная ДНК, плазмидная ДНК и др.). Все нуклеиновые кислоты роднит принципиальное сходство строения. В природных олиго- и полинуклеотидах мономеры (нуклеотиды) связаны 3’,5’-фосфодиэфирными связями. При глубоком гидролизе разрушаются не только фосфодиэфирные, но и гликозидные связи, и нуклеиновые кислоты распадаются до азотистых оснований, моносахаридов и фосфорной кислоты. Как известно, в число канонических (оснувных) азотистых оснований в составе ДНК преимущественно входят аденин, гуанин, цитозин и тимин, а в составе РНК — аденин, гуанин, цитозин и урацил. Реже встречаю-

79

щиеся (минорные) пуриновые и пиримидиновые азотистые основания являются продуктами О-, С- или N-алкилирования канонических азотистых оснований. В тРНК минорные основания могут составлять до 25 %, а в ДНК проростков злаковых, в молоках рыб — до 8—10 %. Ферментативное метилирование нуклеиновых кислот защищает их от разрушения гидролитическими ферментами (нуклеазами). Степень метилирования нуклеиновых кислот связана с генетической активностью. Чем выше степень метилирования, тем эта активность ниже. Такой эффект может устраняться ферментативным деметилированием ДНК и РНК. Механизм регулирования генной активности метилированием во многом относится не только непосредственно к участкам генов, но и к регуляторным участкам ДНК.

Óэукариотов ДНК в основном локализована в ядре, а также

âмитохондриях и хлоропластах, где составляет несколько процентов от общего количества клеточной ДНК. Исключение — яйцеклетки, где доля митохондриальной ДНК (мтДНК) сравнима с количеством ядерной. У прокариотов ДНК представлена в виде нуклеоида (бактериальная хромосома), а также в виде внехромосомной плазмидной ДНК. Только хромосомная ДНК эукариот способна образовывать нуклеопротеины, динамичные комплексы со специфическими ДНК-связывающими белками, и формировать видоспецифическую структуру хромосом. У вирусов ДНК весьма плотно упакована в комплексе с белками.

РНК гетерогенна и представлена в виде матричной РНК (мРНК) — 3—5 %; транспортной РНК (тРНК) — около 10 %; рибосомальной РНК (рРНК) — около 85 % от общего количества РНК в клетке. Общее содержание РНК в клетках составляет от 1 до 7 % сухого вещества. Молекулы РНК менее крупные, чем ДНК, и всегда одноцепочечные. Все виды РНК представляют собой продукты транскрипции ДНК. У эукариотов РНК локализована в ядре, митохондриях, хлоропластах и цитоплазме. Абсолютное содержание ДНК и РНК, а также их соотношение сильно варьирует в клетках разных видов и в разных клетках одного вида. Следует заметить, что во внеклеточной среде обнаруживаются только следовые количества нуклеиновых кислот, по-видимо- му в силу быстрого ферментативного гидролиза активными нуклеазами. Существует нижний предел содержания ДНК в одной клетке — это гаплоидный набор. В соматической клетке верхние пределы содержания ДНК кратны гаплоидному (ди-, тетра-, полиплоидный), а анеуплоидный набор это скорее исключение из

80

правила. Доля ДНК в метаболически активной клетке значи- тельно меньше, чем в метаболически неактивной: например, в сперматозоидах ДНК составляет около 60 % сухого вещества, а в мышцах лишь 0,2 %. С другой стороны, величина отношения содержания РНК к содержанию ДНК в клетке тем выше, чем выше ее метаболическая активность. Сложность и размеры ДНК увеличиваются с усложнением организации живых организмов. Так, например, у бактерий размер генома можно принять равным порядка миллиона пар оснований, где закодировано порядка тысячи белков. А у человека порядка миллиарда пар оснований (в 1000 раз больше, чем у бактерий) кодируют около 30 000 белков, т. е. всего лишь в 30 раз больше, чем у бактерий. Таким образом, параллельно с усложнением организации увели- чивается доля некодирующей ДНК (многократные повторы, интроны, регуляторные участки).

Химическое строение и свойства ДНК

К началу 50-х гг. ХХ в. были получены точные данные рентгеноструктурного анализа кристаллов ДНК, установлены правила Чаргаффа и построена модель структурной организации ДНК. С тех пор представления о структурной организации ДНК, предложенные Ф. Криком, Дж. Уотсоном, М. Уилкинсом и Р. Фрэнклин, безусловно утвердились в качестве фундамента современной биологии. За установление структуры молекулы ДНК и ее роли в передаче наследственной информации Ф. Крик, Дж. Уотсон (США) и

Ì.Уилкинс (Великобритания) в 1962 г. удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине. К этому времени был открыт биохимический механизм биосинтеза нуклеиновых кислот, за что Нобелевская премия 1959 г. была присуждена С. Очоа и А. Корнбергу (США). Огромный вклад в расшифровку генетического кода, в установлении структуры и функции РНК внесли Х. Корана,

Ì.Ниренберг, Р. Холли (США) — лауреаты Нобелевской премии 1968 г. Позднее А. Максам, Ф. Сенгер (Великобритания), У. Гилберт (США) разработали биохимические методы определения первичной структуры ДНК, революционное значение которых также отмечено Нобелевской премией 1980 г. В настоящее время эти идеи и методы легли в основу создания и использования высокоэффективного и вполне экономичного прибора для определения первичной структуры — секвенатора ДНК. Экономичность его работы такова, что стоимость секвенирования гена размером 500 оснований составляет около 100 долларов США.

81