senchuk_v_v_biohimiya_kurs_lekcii
.pdfталлы присутствуют в белках как в виде катионов, так и в виде различных неорганических комплексных соединений. Во многих случаях белки не способны выполнять свои функции без микроэлементов.
Перечень функций белков чрезвычайно разнообразен и, безусловно, включает все проявления жизнедеятельности:
ферментативные;
структурные;
двигательные (сократительные);
регуляторные;
рецепторные;
транспортные;
запасные;
защитные;
преобразования и утилизации энергии.
Классификация и номенклатура белков основана на принципах, которые применимы и для пептидов.
По химическому составу белки делят на простые, а лучше их назвать гомомерные (содержат только аминокислоты), и сложные, или гетеромерные (содержат и неаминокислотные компоненты).
По форме молекулы встречаются глобулярные (сферические или эллипсоидные) и фибриллярные (в виде волокон) белки.
Безусловно, доминируют тривиальные названия белков. Особая номенклатура и классификация ферментов будет рассмотрена в разделе курса лекций «Энзимология».
Биохимические свойства белков
Белки синтезируются исключительно на рибосомах и непосредственно после завершения синтеза вовлекаются в реакции фолдинга — приобретения нативной конформации, а также подвергаются êî- è посттрансляционным модификациям. Время жизни индивидуальных белков варьирует в широких пределах и зависит от соотношения скоростей процессов синтеза белков (транскрипция и трансляция) и гидролиза белков протеолити- ческими ферментами. Время полужизни белков, т. е. период, за который происходит обновление половины молекул определенного белка, обозначаемого как t1/2, строго индивидуально для каждого белка, регулируется и может составлять от нескольких минут для белково-пептидных гормонов до нескольких лет для структурных белков.
32
Биохимические свойства белков зависят от индивидуальных особенностей их аминокислотного состава, плотности упаковки и взаимного расположения остатков аминокислот, наличия определенных функциональных групп в составе боковых радикалов аминокислот, высокополимерной структуры. Все разнообразие функционально-биохимических свойств белков реализуется путем специфического (зачастую стереоспецифического) комплементарного взаимодействия определенных химических структур в молекуле белка с аналогичными участками других белков, а также субстратов, кофакторов, регуляторов и др.
Относительная молекулярная масса белков составляет от 6 тысяч до нескольких миллионов Дальтон (Да). Молекулярная масса индивидуальных кодируемых полипептидных цепей редко превышает 200 000 Да. Одним из самых крупных белков является тиреоглобулин щитовидной железы, полипептидная цепь которого включает около 2750 остатков аминокислот. Более крупные белки обычно формируются за счет ассоциации нескольких (одинаковых или разных) полипептидных цепей (субъединиц) в единую молекулу. Можно считать, что усредненная молекулярная масса белков близка к 40 000 Да. Принимая во внимание среднее значение молекулярной массы кодируемых аминокислот в составе полипептида равное 120 (138—18 (мол. масса воды) = 120), белки содержат не менее 50 аминокислот. Нативные белки с молекулярной массой < 10 000 Да, как правило, не обладают ферментативной активностью.
В зависимости от гидрофобно-гидрофильного баланса радикалов аминокислот белки могут демонстрировать как гидрофильные, так и гидрофобные свойства. В водных растворах молекулы белков гидратированы, и их функциональные группы диссоциируют в зависимости от значения рН среды. Белки способны связывать значительное количество воды и могут набухать. Значения изоэлектрических точек (рI) амфотерных белков строго индивидуальны и в основном лежат в слабокислой области. Исключения: пепсин (pI < 1), цитохром ñ (pI = 10,6). Рассчи- тать рI для белка весьма непросто, поэтому рI белков определяют экспериментально, например методом изоэлектрического фокусирования.
Методы изучения структуры белков
Для анализа белков и пептидов применим весь арсенал мощнейших современных физико-химических методов исследования.
33
Хроматографические методы. Для качественного и количе- ственного анализа белков и пептидов применимы принципы распределительной хроматографии, газовой хроматографии (ГХ), жидкостной хроматографии. Они реализуются в виде тонкослойной хроматографии (ТСХ/TLC), колоночной хроматографии в аналитических и препаративных масштабах. Жидкостная хроматография очень широко применяется в следующих вариантах: ионообменная хроматография, обратнофазовая хроматография, гельпроникающая хроматография (гель-фильтрация), биоспецифическая (аффинная) хроматография. Наиболее популярным современным хроматографическим методом является жидкостная хроматография высокого давления (ЖХВД), или высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ/HPLC). Все хроматографические методы обеспечены автоматизированными приборно-аналитическими комплексами с применением современных компьютерных технологий. Метод ВЭЖХ сочетает уникальный набор достоинств: 1) универсальная применимость для анализа не только белков и пептидов, нуклеиновых кислот, но и любых органических соединений; 2) наивысшая разрешающая способность в разделении биомолекул, включая анализ стереоизомеров; 3) чрезвычайно высокая чувствительность (метод позволяет анализировать фемтомоли белка!); 4) экономичность; 5) высокостабильная воспроизводимость результатов анализа, включая возможности аудиторского контроля результатов. Не случайно в настоящее время ВЭЖХ является основным методом анализа всех органических соединений в биохимии, молекулярной биологии, биотехнологии, фармацевтике, биохимической токсикологии, экологической химии, медицинской химии и др. Поистине революционный переворот происходит благодаря внедрению в лабораторную и производственную практику соче- таний хроматографических методов и масс-спектрометрии, т. е. хромато-масс-спектрометрии. Среди них выделяются такие соче- тания, как ВЭЖХ-масс-спектрометрия (LC/MS) и ГХ-масс- спектрометрия (GC/MS), которые позволяют совершить принципиальный скачок в эффективности идентификации практически любых органических соединений, так как непосредственно сразу после разделения веществ методом ВЭЖХ происходит установление их молекулярной массы с наивысшей точностью и определение их химической структуры. И для этого достаточно совершенно неосязаемых количеств белка или пептида — порядка 10–12—10–15 моль! Сочетание двумерного электрофоретического
34
разделения белков, последующего пептидного картирования белков и ВЭЖХ-масс-спектрометрии продуктов протеолиза составляет роботизированный аналитический комплекс для изуче- ния экспрессии белков в клетках, посттрансляционных модификаций белков и пептидов.
В настоящее время наивысшим методическим достижением в анализе пептидов, белков и нуклеиновых кислот является метод MALDI-TOF. Он сочетает уникальный времяпролетный массспектрометр и технологию селективной лазерной десорбции и возгонки пептидов и олигонуклеотидов. В результате метод MАLDI-TOF все более широко применяется для установления первичных структур пептидов, белков и нуклеиновых кислот и является основным методом в протеомных исследованиях.
Спектральные методы широко используются для качественного и количественного анализа белков и пептидов:
спектры поглощения в ультрафиолетовой и видимой области спектра (UV-VIS-спектроскопия) несут ценную информацию о состоянии соответствующих хромофоров, включая пептидную группу, радикалы ароматических аминокислот, кофакторы, коферменты;
дисперсия оптического вращения (ДОВ) и круговой дихроизм (КД-спектроскопия) позволяют количественно определять вторичную структуру белков и пептидов;
спектроскопия электронного парамагнитного резонанса (ЭПР-спектроскопия) позволяет идентифицировать свободнорадикальные состояния, наличие неспаренных электронов;
спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМРспектроскопия) незаменима для анализа тончайших структурных особенностей пептидов и белков на уровне отдельных группировок и радикалов аминокислот, а также для построения 3Dструктур;
методы определения собственной люминесценции белков дают ценную информацию о тонкой структурной организации остатков триптофана в структуре белка;
для анализа белков и пептидов применяют инфракрасную (ИК) спектроскопию, так как белки поглощают в инфракрасной области спектра за счет остатков карбоксильных, карбонильных, фенильных, тиольных, иминогрупп, аминогрупп и др.
Электрофоретические методы незаменимы для качественного и количественного анализа белков и пептидов, а также для всех амфотерных соединений. Применяются электрофоретиче-
35
ские методы для аналитического и препаративного разделения белков (пептидов) по величине их молекулярной массы, по заряду, по значению изоэлектрической точки. Изоэлектрическое фокусирование, т. е. разделение белков (пептидов) по значению их изоэлектрических точек, относится к числу наиболее мощных физико-химических методов анализа белков и позволяет надежно отделить друг от друга мутантные белки, отличающиеся от исходных белков всего лишь заменой одной аминокислоты. Двумерный электрофорез представляет собой сочетание разных электрофоретических методов, что дает уникальную возможность воспроизводимо, точно и быстро осуществлять разделение очень сложных белковых смесей. Например, в одном эксперименте с помощью прибора, размер которого ненамного превышает формат книги, можно разделить и «увидеть» около 1000 различных белков. Двумерный электрофорез позволяет получать пептидные карты белков и сравнивать их первичные структуры, создавать библиотеки двумерных белковых электрофореграмм различных типов клеток разных организмов. Такая информация уже сегодня доступна при обращении к специализированным электронным ресурсам типа SwissProt и Protein Data Bank. Капиллярный электрофорез в максимальной степени развивает принципиальные аналитические возможности электрофорети- ческого разделения заряженных молекул, что ставит этот метод в один ряд с наиболее эффективными хроматографическими методами. К числу новейших достижений в области разработок методов электрофоретического анализа относятся специальные микрочипы, в которых объединяются достижения микроэлектроники, компьютерных технологий и методов электрофореза. В миниатюрных каналах микрочипов происходит не только электрофоретическое разделение биомолекул, но и непосредственный контроль и идентификация, а также количественный анализ.
Химические методы не утрачивают применимости для качественного и количественного анализа белков и пептидов. Химиче- ские свойства белков во многом определяются свойствами функциональных аминокислотных радикалов. В отличие от свободных аминокислот для белков и пептидов характерна весьма специфи- ческая биуретовая реакция, которая основана на координировании ионов меди с атомами пептидной связи в щелочной среде с образованием фиолетового комплекса. С остатками ароматических аминокислот в составе белков и пептидов специфически реагирует реактив Фолина с образованием окрашенных продуктов реакции. Белки можно анализировать и методом Кьельдаля по количеству
36
выделившегося аммиака после кислотного сжигания белка или пептида. Белки также способны связываться с различными кислотными красителями, подвергаются модификации флуоресцентными, фотоактивируемыми, парамагнитными реагентами, которые специфичны к определенным функциональным группам остатков аминокислот. Все эти методы и реагенты широко используются для качественного и количественного анализа белков.
Модификация определенных функциональных групп остатков аминокислот специфическими химическими реагентами, использование особых химических реагентов, так называемых молекулярных зондов и меток (радиоизотопные, люминесцентные, ЭПР), помогают установить тонкую структуру белков и пептидов, уточнить взаимное расположение аминокислотных радикалов в молекуле. Поскольку доступность радикалов аминокислот для модификации специфическими химическими реагентами сильно меняется в зависимости от состояния белка, химическая модификация функциональных центров белков дает ценную информацию о биохимических механизмах работы и организации активных, регуляторных центров белков.
Кристаллизация белков и пептидов позволяет эффективно применить мощнейший арсенал методов рентгеноструктурного анализа и построить трехмерные атомарные структуры белков и пептидов с точностью до расположения одиночных атомов водорода (3D-структуры белков). Строение крупных белков, надмолекулярных комплексов белков можно «рассмотреть» с помощью высокоразрешающих методов электронной микроскопии.
Современные технологии компьютерного моделирования è
прогнозирования структуры белков и пептидов становятся все более информативны и применимы для установления структурной организации биомолекул, построения 3D-моделей белков.
Структурная организация белков
В структуре белков обнаруживают несколько дискретных уровней организации, которые демонстрируют динамичность, осуществляют взаимопревращения, стабилизированы разнообразными химическими связями и определяют все богатство функциональных свойств белков. Детальная структурная организация каждого белка строго индивидуальна, а для сходных белков видо- и тканеспецифична. В структуре белков существуют следующие уровни:
первичная структура;
вторичная структура;
37
третичная структура;
доменная структура;
четвертичная структура;
надмолекулярные комплексы.
Первичная структура — это последовательность чередования -L-аминокислот в полипептидной цепи, соединенных пептидными связями. Вращение относительно пептидной связи затруднено, что ограничивает разнообразие конформаций белка. Первичная структура белков закодирована в первичной структуре гена. Согласно правилам номенклатуры, для полного названия белка и записи его первичной структуры используют чередующиеся одноили трехбуквенные сокращенные обозначения тривиальных названий аминокислот. Аминокислоты в белках нумеруются с N-конца, который при записи располагают слева, а в названиях всех аминокислот, кроме С-концевой, оконча- ние -ин (-ан) меняется на -ил.
В настоящее время реализуются две принципиальные возможности установления первичной структуры белков и пептидов. Во-первых, возможно установление первичной структуры соответствующего гена. В этом случае принципиально важной задачей является получение кодирующей части гена (в особенности для генов эукариот) для последующего секвенирования. В результате, используя правила генетического кодирования, можно перевести первичную структуру гена в первичную структуру белка.
Во-вторых, возможно установление первичной структуры белка путем непосредственного секвенирования белка или пептида. При этом важнейшим условием успеха является работа с высокоочищенными белками или пептидами. Вместе с тем, даже зная полную первичную структуру белка, крайне затруднительно однозначно и точно воспроизвести первичную структуру гена, кодирующего определенный белок. Причина заключается в том, что генетический код вырожден и большинство аминокислот кодируется более чем одним кодоном (триплетом оснований ДНК).
Схема анализа первичной структуры белков и пептидов включает:
получение высокоочищенных белков и пептидов;
определение молекулярной массы и состава субъединиц (если они есть) методами электрофореза и жидкостной хроматографии;
38
количественный аминокислотный анализ белка осуществляется с помощью специального оборудования — аминокислотного анализатора или жидкостного хроматографа высокого давления (ЖХВД или ВЭЖХ);
определение N- и C-концевых аминокислот в белках и пептидах;
пептидное картирование белка осуществляется путем протеолиза белка высокоспецифичными (трипсин, протеаза V8 и др.) или малоспецифичными (химотрипсин, папаин и др.) протеолитическими ферментами; полученные пептиды разделяются
âпространстве методами ВЭЖХ, тонкослойной хроматографии, методами одномерного, двумерного и капиллярного электрофореза;
получение высокоочищенных пептидов методами хроматографии и электрофореза;
секвенирование пептидов — установление первичной структуры пептидов с помощью специального прибора — секвенатора, который осуществляет поэтапную химическую модификацию N-концевой аминокислоты в пептиде, ее отщепление от пептида и определение этой аминокислоты; такая процедура затем повторяется до тех пор, пока не будет полностью «разрезан» пептид.
Структурная изомерия белков может быть связана с изменением порядка чередования аминокислот. Так, например, пепти-
äû Í2N-X-X-X-Y-X-ÑÎÎÍ è Í2N-X-X-Y-X-X-СООН при одинаковой брутто-формуле будут различаться по химическому строе-
нию, конформации и биохимическим свойствам. Потенциальное биоразнообразие белков потрясает воображе-
ние. Так, для среднего белка из 300 аминокислот, построенного только лишь из 20 кодируемых аминокислот, теоретическое число вариантов различных первичных структур составляет фантастическую величину — 20300! Если предположить невероятное, что за всю историю жизни на Земле существовал 1 млрд биологических видов с индивидуальным набором из 100 тыс. белков, то получится, что природа испробовала всего лишь 1014 разных белков. Таким образом, в процессе биологической эволюции на Земле отобрано ничтожное количество белковых структур из потенциально возможных. Такова удивительная результативность эволюционных процессов.
В геноме риса кодируется около 50 тыс. различных белков, в клетках человека кодируется около 30 тыс. различных белков, в
39
клетках бактерий может быть несколько тысяч белков, а некоторые вирусы имеют всего лишь несколько белков. В специализированных клетках многоклеточных организмов экспрессируются далеко не все белки, закодированные в геноме. Существуют специальные механизмы регуляции экспрессии белков в прокариотических и в эукариотических клетках.
В настоящее время интенсивно развиваются научные программы по геномике, включающие расшифровку первичной структуры ДНК наиболее важных биологических видов: ценных сельскохозяйственных растений (пшеница, рис, соя, овес и др.), патогенных бактерий и вирусов, мыши и человека. С другой стороны, выполняются и программы по протеомике, которые нацелены на установление структур экспрессируемых белков и пептидов. Протеомные и геномные исследования необходимы хотя бы потому, что генетический код вырожден, т. е. большинство аминокислот кодируется более чем одним триплетом. Из этого следует, что, зная только первичную структуру белка, трудно построить однозначную первичную структуру гена. Первичные структуры, пептидные карты белков накапливаются в компьютерных базах данных типа SwissProt. Аналогичные базы данных созданы и для аккумулирования информации в отношении вторичной, третичной и четвертичной структур белков и пептидов. Они используются для оперативного сравнительного анализа структурной организации новых белков, а также для компьютерного моделирования конформации белков и пептидов, исходя лишь из знания их первичных структур. В настоящее время в базах данных содержится информация о первичных структурах нескольких десятков тысяч белков, и эти данные постоянно пополняются.
Не все белки обязательно содержат 20 кодируемых аминокислот, так же как и не весь спектр посттрансляционно модифицированных аминокислот. В среднем в структуре белков кислых аминокислот несколько больше, чем основных.
Как правило, Лей, Лиз, Асп, Глу содержатся в белках в наибольших количествах (до 15 %), а Трп, Цис, Гис — в наименьших (около 2 %). Содержание остальных занимает промежуточ- ные значения. Обычно выполняются и такие правила в отношении содержания аминокислот в белках: Лей > Иле, Глу > Асп, Сер > Тре.
Аминокислотный состав гистонов, протаминов, цитохрома ñ значительно обогащен оснoвными аминокислотами. Напротив, в белках семян злаковых до 25 % могут составлять кислые амино-
40
кислоты. В коллагенах необычайно много остатков аланина, глицина, пролина и гидроксипролина, в фиброине шелка до 37 % приходится на аланин, серин и до 50 % на глицин. В кератинах, как, например, в панцире черепах, содержание цистеина может достигать 18 %, что создает обилие дисульфидных связей и придает особую прочность конструкции. Протеогликаны соединительной ткани имеют еще более упрощенный аминокислотный состав.
Повторяющиеся последовательности аминокислот в одной и той же молекуле белка встречаются редко. Вместе с тем высока вероятность гомологии в организации сходных функциональных центров в различных белках, т. е. одинаковые функции, обслуживаются гомологичными по структуре белками. Чем выше степень гомологии первичных структур белков разных видов, функции которых идентичны или близки, тем ближе родство этих биологических видов. Знание первичных структур позволяет строить генеалогические деревья.
Внутривидовая микрогетерогенность белков, вероятно, имеет почти универсальное распространение. Она может быть связана с существованием близкородственных генов, что ведет к экспрессии изоформ белков, т. е. белков с несколько различной первичной структурой, но в принципе с одинаковой функцией. Функциональные различия изоформ белков связаны с некоторыми нюансами в проявлении активности и в ее регуляции. Вторая причина микрогетерогенности белков и пептидов связана с различиями в посттрансляционных модификациях аминокислотных остатков одной и той же полипептидной цепи. В результате появляется серия белков с идентичной первичной структурой, но с разной степенью фосфорилирования, гликозилирования или какой-либо другой модификации. Наконец, множественные формы белков и пептидов могут появляться на базе единственной первоначально неактивной полипептидной цепи в результате неоднозначной активации в реакциях ограниченного протеолиза. При этом образуется несколько белково-пептидных продуктов с родственными первичными структурами. Микрогетерогенность создает тонкую вариабельность белковых структур и функций, пластичность регуляции. Родственные по первичной структуре белки и пептиды объединяются в соответствующие семейства.
Существует также тканеспецифическая микрогетерогенность для многих белков, что обусловлено функционированием
41