senchuk_v_v_biohimiya_kurs_lekcii

Еще в начале 1970-х гг. усилиями Х. Кораны были созданы методы химического синтеза нуклеиновых кислот, которые сегодня реализованы в виде специальных приборов — синтезаторов нуклеиновых кислот, активно используемых для получения разнообразных олигонуклеотидов. К этому следует добавить достижения в области биохимии рекомбинантных ДНК (П. Берг, 1980), а также определение структуры нуклеопротеиновых комплексов методами электронной микроскопии (А. Клуг, 1982). Результаты всех этих, а также и огромного числа других работ многие годы служат в качестве научно-теоретической и методи- ческой основы не только в области биохимии нуклеиновых кислот, но и всей современной биологии.

Молекулы дезоксирибонуклеиновых кислот отличаются наиболее сложным строением среди всех биомолекул, а возможно, и среди всех органических соединений. Молекулы ДНК могут состоять из миллиардов атомов! Размер ДНК варьирует от нескольких десятков тысяч Да (ДНК вирусов) до 1012—1014 Да (ДНК эукариот).

ДНК — это волокнистые вещества белого цвета, плохо растворимые в воде, хорошо растворимые в концентрированных растворах NaCl, теряющие растворимость при добавлении спиртов (этанол, изопропанол). Растворы ДНК обладают высокой вязкостью, оптической активностью, поглощают ультрафиолет в области 260 нм за счет ароматических структур азотистых оснований.

В строении ДНК (как и белков) выделяют несколько дискретных уровней организации: первичную, вторичную, третич- ную структуры и надмолекулярные комплексы.

Первичная структура ДНК — это последовательность чередования 2-дезокси-D-нуклеозидов в полинуклеотидной цепи (нити) ДНК, которые соединены друг с другом 3’,5’-фосфодиэфир- ными связями (рис. 17). Поэтому мономерами ДНК являются дезоксинуклеозидмонофосфаты. Остатки фосфорной кислоты и моносахаридов образуют так называемый сахарофосфатный полимерный остов молекулы ДНК. В ДНК 2’-дезокси-D-рибофура- ноза связана по С-1 N-гликозидной связью с азотистыми основаниями. Причем все гликозидные связи имеют -конфигурацию. Отсутствие гидроксила при С-2 в значительной степени обеспе- чивает бoльшую компактность ДНК по сравнению с РНК. Гидроксил во втором положении определяет специфичность распознавания белками клетки ДНК и РНК. Гидроксилы в третьем и пятом положениях остатков 2’-дезокси-D-рибофуранозы образуют эфирные связи с остатками фосфорной кислоты.

82

Ðèñ. 17. Первичная структура ДНК

По правилам написания первичной структуры слева располагают 5’-конец, а справа — 3’-конец полинуклеотида. Сама же первичная структура пишется с использованием первых заглавных букв названий азотистых оснований. На 3’-конце ДНК обычно находится свободная ОН-группа.

Не только все молекулы ДНК, но и РНК характеризуются принципиально сходным планом строения:

83

В настоящее время завершается установление полной первичной структуры ДНК человека (около 27 000 генов), полностью известна первичная структура ДНК мыши, риса, дрожжевых клеток, нескольких десятков различных бактерий и большинства вирусов. Разработаны специальные биохимические технологии быстрого сравнения первичных структур ДНК без использования метода секвенирования. Такие технологии реализуются несколькими способами. Сходство первичных структур можно эффективно определять, сравнивая фингерпринты («отпечатки пальцев») различных молекул ДНК, которые подвергают контролируемому расщеплению рестриктазами на фрагменты и анализируют эти фрагменты методом электрофореза. Поскольку первичная структура ДНК каждого организма строго индивидуальна, то и набор получаемых и анализируемых фрагментов ДНК также индивидуален. Другой подход заключается в возможности наработки практически любых гомологичных участков сравниваемых молекул ДНК. Такие относительно небольшие фрагменты ДНК сравнивают друг с другом как по размерам, так и по наличию замен азотистых оснований. Тем самым получают ценную информацию о сходстве или различии первичных структур не всей ДНК, а каких-либо ее участков. Первичные структуры нуклеиновых кислот накапливаются и анализируются различными организациями, к которым открыт свободный доступ через Интернет (например, база данных Gen Bank). Митохондриальная ДНК значительно уступает в размерах молекулам ядерной ДНК. Например, ДНК митохондрий че- ловека содержит всего лишь 37 генов, включая 2 гена рРНК, 22 гена тРНК и 13 генов, кодирующих белки.

Теоретическое количество различных первичных структур, т. е. потенциальное биоразнообразие генотипов и, следовательно, видов, создает очень сильное впечатление. Так, например, если геном (ДНК) бактерии состоит из 1 млн остатков дезоксирибонуклеотидов, то при использовании четырех разных дезоксирибонуклеотидов можно получить 41000000 разных первичных структур! Для эукариотических организмов потенциал биораз-

нообразия имеет вовсе космические величины порядка

410000000000!

Первичная структура нуклеиновых кислот в целом нерегулярна. Вместе с тем большая часть некодирующей ДНК относится к так называемым многократным повторам. К многократным повторам принадлежат, как правило, небольшие фрагменты

84

ДНК (часто в пределах 50 пар оснований), которые могут порой повторяться в геноме десятки тысяч раз. Среди них обнаруживаются теломеры (ТТАГГГ), которые сконцентрированы на концах хромосомной ДНК группами (кластерами) по 120—130 штук. С каждым делением клеток может происходить укорочение концевых участков хромосомной ДНК на один теломер. За 40—60 делений может происходить полное отщепление теломеров, а при последующих делениях начинают отщепляться участки структурных генов и запускается программа старения и гибели клеток. В клетках существует фермент теломераза, который способен в процессе деления достраивать утраченные теломерные участки. Активность и количество этого фермента очень резко увеличивается при злокачественной трансформации клеток. Как предполагается, теломеры работают как своеобразные молекулярные часы, отсчитывающие время жизни организма от его зарождения до гибели.

Первичная структура ДНК хранит фантастические объемы информации. Так, если просто записать первичную структуру ДНК всех хромосом человека, то текст составит более 1 млн страниц формата настоящей книги!

Строение ДНК характеризуется несколькими правилами, которые к 1949 г. установлены Э. Чаргаффом путем точного химического анализа очищенных препаратов ДНК, полученных из разных биообъектов:

1.Сумма пуриновых азотистых оснований равна сумме пиримидиновых, [А + Г] = [Т + Ц].

2.Молярное содержание аденина равно молярному содержанию тимина, [А] = [Т].

3.Молярное содержание цитозина равно молярному содержанию гуанина, [Ц] = [Г].

4.ДНК разных биологических видов может отличаться по величине соотношения [Г + Ц]/ [А + Т]: для высших животных и высших растений обычно это отношение < 1, следовательно, у них ДНК АТ-типа; для микроорганизмов отношение сильно варьирует от 0,4 до 2,5 и часто > 1, т. е. у них ДНК ГЦ-типа.

Правила Чаргаффа применимы только для двуцепочечных линейных или кольцевых ДНК всех организмов, не зависят от пола, возраста, стадии развития. Одноцепочечные ДНК в природе встречаются относительно редко, главным образом у некоторых ДНК-содержащих вирусов.

85

Все нуклеиновые кислоты — это полианионы при физиологических значениях рН среды. Этим обусловлена способность ДНК образовывать ионные связи с катионами Mg и Ca, с положительно заряженными диаминами (спермин, спермидин), структурными белками гистонами и протаминами, а также с многочисленными регуляторными белками. Белки-регуляторы и ферменты, взаимодействующие с нуклеиновыми кислотами, распознают специфические участки связывания в структуре ДНК, которые зачастую представляют собой палиндромы, шпильки, петли и имеют своеобразную, причудливую форму.

Вторичная структура двуцепочечных ДНК представлена в виде двойной спирали (рис. 18). В ней две полинуклеотидные цепи расположены антипараллельно, связаны друг с другом за счет комплементарных взаимодействий между азотистыми основаниями и дополнительно стабилизированы стэкинг-взаимодействия- ми между -электронными облаками соседних пар азотистых оснований. Спираль может быть право- и левозакрученной. Азотистые основания локализованы внутри спирали, а сахарофосфатный остов снаружи, следовательно, на поверхности спирали локализованы отрицательные заряды. Разнообразные низкомолекулярные соединения способны специфически связываться с ДНК, приводя к нарушению структурно-функциональных свойств биополимера. В этом заключается механизм цитотокси- ческого действия многих антибиотиков. Физико-химическая основа комплементарных взаимодействий заключается в образовании водородных связей между пуриновыми и пиридиновыми азотистыми основаниями: 2 связи между А и Т (или У), 3 связи между Г и Ц. Следовательно, комплементарные взаимодействия могут возникать между ДНК и ДНК, ДНК и РНК, РНК и РНК. Таким образом, первичные структуры каждой из двух полинуклеотидных нитей не идентичны, а комплементарны и, следовательно, весьма существенно отличаются друг от друга по первич- ной структуре.

Комплементарные взаимодействия реализуются за счет водородных связей несколькими способами (рис. 19): 1) между атомом водорода аминогруппы одного гетероцикла и карбонильным атомом кислорода другого гетероцикла; 2) между неподеленной парой электронов атома азота одного гетероцикла и атомом водорода при пиррольном азоте другого гетероцикла. Связь между гуанином и цитозином несколько прочнее, чем между аденином

èтимином. Антипараллельность комплементарных цепей

86

Ðèñ. 18. Схема организации двуцепочечной ДНК

ДНК-ДНК и ДНК-РНК определяется стерическими особенностями образующихся водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями, т. е. при параллельном расположении двух комплементарных полинуклеотидов водородные связи и двойная спираль не образуются. Водородные связи на 2—3 порядка слабее ковалентных, но общая стабильность комплементарных взаимодействий между полинуклеотидными нитями достигается за счет многочисленности водородных связей. Длину двуцепочечных нуклеиновых кислот обозначают т.п.о. (тысяч пар оснований) или kbase. Поскольку на каждые 0,34 нм спирали ДНК умещается одна пара азотистых оснований, то общая протяженность хромосомной ДНК человека (3 миллиона т.п.о.) составит около 1 м! До сих пор сохраняется проблема получения неразорванных (нативных) высокомолекулярных ДНК хромосом, так как огромные линейные молекулы ДНК легко разрушаются на фрагменты даже при легком перемешивании раствора.

87

Такие биспиральные структуры могут образовывать две нити ДНК, две нити РНК, участки одиночных нитей ДНК и РНК, а также гетеродуплексы, содержащие одну нить ДНК и одну — РНК. Среди вторичных структур нуклеиновых кислот выделяют

Ðèñ. 19. Комплементарность несколько форм. Этот поли-

азотистых оснований

морфизм развит в большей степени для ДНК. Существуют как природные, так и искусственные формы нуклеиновых кислот. Разные формы могут переходить друг в друга. Основные формы ДНК обозначают латинскими буквами A, B, C, D, T, Z. Штрихами обозначаются формы, близкие к основным формам: A’, B’, C’… и A”, B” и др. Шаг спирали варьирует для разных форм ДНК. Толщина спиралей ДНК обычно составляет 1,8—2 нм. К правозакрученным спиралям относится В-форма ДНК, которая характерна для ДНК с содержанием воды > 40 %. Вероятно, именно В-форма ДНК доминирует в клетках эукариотов и у прокариотов. В этом случае шаг спирали равен 3,4 нм и на него приходится 10 пар азотистых оснований. Угол между плоскостью пар оснований и осью спирали равен 90 . А-форма ДНК образуется при содержании воды < 20 %, т. е. в кристаллах ДНК. Шаг спирали равен 2,8 нм, на него приходится 11 пар оснований. А-форма на 20 % компактнее, чем В-форма. Считают, что А-форма доминирует в гетеродуплексах ДНК-РНК, а также присутствует в двуцепочечных РНК.

Специальными методами обнаруживаются в клетках и in vitro левозакрученные спирали в виде зигзагообразных полинуклеотидных цепей (Z-форма). Установлено, что возможны переходы между B- и Z-формами, а метилирование стабилизирует Z-форму ДНК. Показано, что одним из способов регулирования активности генов является контролируемый специальными белками обратимый процесс B-Z перехода.

Третичная структура и надмолекулярные комплексы ДНК

Кольцевая ДНК. В кольцевых ДНК свободные концы линейной двуцепочечной молекулы ДНК ковалентно замкнуты, образуя кольцо Мебиуса. К этому типу относится ДНК митохондрий

88

и хлоропластов. В составе хромосом существуют участки амплифицированной ДНК, которая тоже является двуцепочечной и кольцевой. Бактериальная хромосома и плазмиды (внехромосомные автономные генетические элементы бактерий) являются двуцепочечными кольцевыми молекулами ДНК.

Суперспирали в ДНК образуются в результате обратимой ферментативной реакции с участием топоизомеразы I и топоизомеразы II. Фермент первого типа осуществляет разрыв одиноч- ной цепи в двуцепочечной кольцевой ДНК, поворачивание цепей

âместе разрыва и их ковалентное сшивание. Фермент второго типа работает сходным образом, разрушая обе цепи двуцепочеч- ной молекулы. Эти ферменты активны в клетках бактерий и в эукариотических клетках, регулируют топологию ДНК — суперспирализацию ДНК. Суперспираль может быть как положительной, так и отрицательной. Суперспираль — это напряженная структура, своеобразная форма запасания энергии. Эта энергия используется в процессе расплетания нитей ДНК в ходе репликации и транскрипции.

Бактериальная хромосома — это кольцевая двуцепочечная ДНК, которая содержит суперспиральные участки, образующие различные петли. У бактерий нет гистонов и нет нуклеосомной организации ДНК. ДНК бактериальной хромосомы нековалентно связывается с ферментами и регуляторными белками. Кроме хромосомы в бактериях существуют нехромосомные генетические элементы — плазмиды. Плазмиды значительно меньше по размерам (обычно 2—6 т.п.о.), чем бактериальная хромосома, и, следовательно, включают лишь несколько генов. Плазмиды представлены в виде кольцевых двуцепочечных суперспиральных ДНК. Существуют многокопийные (более 10 копий на клетку) и малокопийные плазмиды. Плазмиды кодируют белки, определяющие устойчивость бактерий к антибиотикам, кодируют рестриктазы, служат для переноса генетической информации между бактериальными клетками.

Фазмиды è космиды в чем-то похожи на плазмиды, но в отличие от плазмид построены на основе сочетания структуры и свойств ДНК бактериофагов и плазмид. Они способны включать

âсостав ДНК несколько чужеродных генов, автономно реплицироваться в инфицированных клетках и упаковывать свою ДНК в белковую головку образуемого бактериофага. Существуют специальные биохимические методы изменения структуры (кон-

89

струирования) фазмид, плазмид и космид с целью придания им требуемых свойств. Главным является возможность встраивать с помощью специальных ферментов чужеродные гены или их участки в структуру ДНК фазмид, плазмид и космид, создавая искусственные молекулы ДНК, так называемые рекомбинантные нуклеиновые кислоты. Таким образом, фазмиды, плазмиды

èкосмиды широко используются в качестве векторов для передачи, хранения, воспроизведения и экспрессии в клетках микробов практически любых генов, которые можно получить из любых живых объектов. Фазмиды, плазмиды и космиды — это абсолютно незаменимый молекулярный инструмент в биохимии, молекулярной биологии, биотехнологии, генетической инженерии. В последние годы создана и используется уникальная биотехнология борьбы со злокачественными опухолями человека — генотерапия рака. В генотерапии рака применяют более сложные векторы на основе модифицированных вирусов человека, в которые встраивают те гены человека, которые повреждены или не работают в злокачественных клетках. Таким образом достигается целенаправленное исправление генов, отвечающих за ограничение злокачественного роста, и полное излечение от рака.

Линейная ДНК. Линейная ДНК в свободном состоянии крайне неустойчива и без защитного метилирования легко разрушается нуклеазами. В клетках эукариотов существует в виде комплекса с белками (дезоксирибонуклеопротеин), образует хроматин è хромосомы. У прокариотов (бактериофагов) встречается одноцепочечная линейная ДНК в очень жестком комплексе с белками.

Хромосомы эукариотов представляют собой наиболее сложный уровень организации ДНК в клетках. Это надмолекулярные дезоксирибонуклеопротеиновые структуры. Обычно каждая хромосома содержит одну двуцепочечную молекулу ДНК. В основе структуры хромосом лежит хроматиновая организация ДНК.

Хроматин — это нековалентный комплекс ДНК, особых структурных белков (гистонов, реже протаминов) и некоторых негистоновых белков. Гистоны очень консервативны по первич- ной структуре. Они подвергаются обратимым и регулируемым реакциям ацетилирования, метилирования, фосфорилирования

èАДФ-рибозилирования. Это приводит к изменению свойств и структуры хроматина. В 1974 г. была обнаружена нуклеосомная структура хроматина (так называемые «бусинки на ниточке»). Каждая нуклеосома состоит из четырех пар молекул гистонов

90

(H2A, H2B, H3, H4), вокруг которых закручен участок ДНК длиной 146 пар оснований. Нуклеосомы отделены друг от друга линкерными участками ДНК длиной 60 пар оснований. Таким образом, ДНК клеток человека может содержать порядка 10 млн нуклеосом! При этом нуклеосомная структура ДНК совершенно не мешает процессу транскрипции. Дальнейшее усложнение структуры ДНК заключается в плотной упаковке хроматина в виде хроматиновой фибриллы с диаметром 30 нм. В ее стабилизации принимает участие гистон Н1. Фибриллы образуют петли, которые удерживаются с помощью специфических белков. Этими сведениями далеко не исчерпываются представления о структурной организации хромосом, которая до сих пор окончательно не установлена. Принципиально важно то, что обратимое и регулируемое усложнение структуры нуклеиновых кислот это не только путь компактизации генетического материала, но и способ регуляции активности генов.

Химическое строение и свойства РНК

Структура и свойства тРНК. В 1965 г. Р. Холли с сотрудниками впервые установили первичную структуру тРНК для аланина (тРНКÀëà), выделенную из дрожжей. К настоящему времени полностью установлена первичная структура рРНК и тРНК наиболее изученных организмов (человек, мышь, дрожжи, микроорганизмы). Транспортные РНК — это самые маленькие представители нуклеиновых кислот, одноцепочечные РНК, содержат от 74 до 95 оснований. У каждого организма обнаружено не менее 20 различных тРНК. Их число больше, чем число кодируемых аминокислот, но меньше числа кодонов. Следовательно, существуют изоакцепторные тРНК, которые отличаются по первичной структуре, но связывают одну и ту же аминокислоту. В составе тРНК обнаружено около 50 минорных оснований, которые составляют 10—19 % общего нуклеотидного состава. В тРНК в основном доминируют гуанин и цитозин (около 60 %). Примерно 60 % азотистых оснований в составе тРНК спарены за счет комплементарных взаимодействий и образуют небольшие спиральные участки, шпильки и петли (рис. 20). У всех тРНК на 3’-конце находится последовательность ЦЦА, к которой присоединяется активированная аминокислота. тРНК образует вторичную и третичную структуру, которая имеет характерный вид клеверного листа. Таким образом, функция тРНК во всех клетках заключается в акцептировании (связывании) той аминокислоты, которая закодирована в структуре антикодона тРНК.

91