Принцип метода:

В основу метода положена способность -липопротеидов (ЛПНП) осаждаться в присутствии хлорида кальция и гепарина; при этом изменяется мутность раствора. По степени помутнения раствора и судят о концентрации -липопротеидов в сыворотке крови. Считают, что гепарин способен образовывать с -липопротеидами комплекс, который под действием хлорида кальция выпадает в осадок.

Реактивы, оборудование и исследуемый материал:

1. Хлорид кальция (CaCl₂) 0,27%-ный раствор (готовят из безводного реактива).

2. Гепарин, 1%-ный раствор (готовят ex tempore) ,1 мл его должен содержать 1000 ЕД (лучше кристаллический).

3. Фотоэлектроколориметр.

4. Микропипетка ёмкостью 0,2 мл.

5. Сыворотка крови.

Ход работы.

В пробирку вносят 4 мл 0,27%-ного раствора CaCl₂ и 0,4 мл сыворотки крови и перемешивают. Определяют оптическую плотность раствора (Е₁) против 0,27%-ного раствора CaCl₂ по левому барабану в кюветах на 5 мм, при красном светофильтре (630 нм). Раствор из кюветы переливают в пробирку, добавляют микропипеткой 0,08 мл 1%-ного раствора гепарина, перемешивают и точно через 4 мин снова определяют оптическую плотность раствора (Е₂) в тех же условиях:

Х = (Е₂ - Е₁)  1000

Расчет. Вычисляют разность оптической плотности и умножают её на 1000 - коэффициент эмпирический, предложен Ледвиной, так как построение калибровочной кривой сопряжено с рядом трудностей. Ответ выражают в г/л. В норме содержание -липопротеидов составляет 3 - 4,5 г/л (300 - 450 мг/%). Содержание -липопротеидов колеблется в зависимости от возраста и пола.

Примечание. Сыворотку крови, содержащую гепарин, для данного анализа использовать нельзя.

Контрольные вопросы:

1. Что такое липопротеиды?

2. Какие функции выполняют липопротеиды?

3. На чем основан метод определения липопротеидов?

4. При каких патологических состояниях наблюдается нарушение нормальной концентрации липопротеидов крови?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 16.

Тема: «определение содержания общих липидов в сыворотке крови».

Для определения липидов сыворотку предварительно гидролизуют концентрированной серной кислотой. Продукты распада липидов образуют с фосфорнованилиновым реактивом окрашенное соединение, интенсивность окраски которого определяют колориметрически.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ: сыворотка крови.

РЕАКТИВЫ: 1) Концентрированная серная кислота. 2) Фосфорнованилиновая смесь (4 части фосфорной кислоты и 1 часть 0,6%-ного раствора ванилина).

ОБОРУДОВАНИЕ: 1) Сухие пробирки. 2) Пипетки. 3) Водяная баня. 4) ФЭК. 5) Кюветы с толщиной слоя 0,5 см.

ХОД РАБОТЫ

Для гидролиза 0,1 мл (2 капли) сыворотки смешивают с 5 мл серной кислоты (конц.), перемешивают и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. Одновременно готовят контрольный раствор: в пробирке тщательно смешивают 0,1 мл (2 капли) дистиллированной воды и 5 мл конц. серной кислоты и оставляют стоять при комнатной температуре.

После окончания гидролиза колбу с гидролизатом охлаждают до комнатной температуры, отбирают 0,2 мл (4 капли) и добавляют 3 мл фосфорнованилиновой смеси, тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 – 15 мин. Таким же образом смешивают с фосфорнованилиновой смесью контрольный раствор. Интенсивность окрашивания измеряют на ФЭК, длина волны 540 нм.

Количественное содержание липидов рассчитывают по формуле:

С липидов = 38,5  (Д пробы – Д контроля)

Результаты заносят в рабочую тетрадь.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 17.