Весенний семестр.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 11.
Ортотолуидиновый метод: определение глюкозы в сыворотке крови.
Глюкоза при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты дает синезеленое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы и определяется на фотоэлектроколориметре:
Орто-толуидин глюкоза
С ортотолуидиновым реактивом реагируют все альдогексозы, но их содержание в крови невелико, поэтому метод позволяет определить практически одну глюкозу.
РЕАКТИВЫ: 1. Трихлоруксусная кислота, 3%-ный раствор.
2. Ортотолуидиновый реактив.
3. Стандартный раствор глюкозы, 1 г/л (100 мг % раствор), готовят ex tempore.
ОБОРУДОВАНИЕ: Центрифуга, центрифужные пробирки, микропипетка вместимостью 0,1 мл, пипетка вместимостью 1 мл, ФЭК, кровь или сыворотка крови.
Ход работы:
В две пробирки наливают по 0,9 мл (18 капель) 3%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, затем в одну из них вносят 0,1 мл (2 капли) крови, взятой из пальца (или сыворотка крови), а в другую – 0,1 мл (2 капли) стандартного раствора глюкозы. Содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 10 минут. Для определения берут по 0,5 мл (10 капель) надосадочной жидкости из каждой пробирки, вносят в обычные сухие пробирки, добавляют по 4,5 мл ортотолуидинового реактива и помещают пробирки в кипящую водяную баню на 8 мин. Необходимо следить, чтобы вода в бане непрерывно кипела. Вынимают пробирки и охлаждают их водопроводной водой до комнатной температуры. Затем измеряют на фотоэлектроколориметре оптическую плотность проб в кюветах на 10 мм против воды с красным светофильтром (620 нм); поскольку контроль на реактивы на ФЭК равен нулю, окраска ортотолуидинового реактива не развивается.
РАСЧЕТ: Содержимое глюкозы в опытной пробе рассчитывают по стандартному раствору глюкозы по формуле:
Сст Еоп
Соп = ——————,
Ест
где Соп – концентрация глюкозы в крови в пробе, ммоль/л; Сст – концентрация глюкозы в стандартной пробе,100 мг/100 мл; Еоп – оптическая плотность пробы; Ест – оптическая плотность стандарта глюкозы. Коэффициент пересчета в единицы СИ (ммоль/л) равен 0,0555.
Нормальное содержание глюкозы в сыворотке крови человека, определяемое ортотолуидиновым методом, колеблется в пределах 3,33-4,99 ммоль/л (60-90 мг%).
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 12
Тема: «ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ В МОЧЕ».
Исследуемый материал: моча.
Реактивы: бумага реактивная «Глюкотест».
ХОД РАБОТЫ:
Полностью смочить в моче желтую полоску реактивной бумаги.
Поместить реактивную бумажку на пластмассовую пластинку и выдержать около 5-10 минут.
Сравнить изменившуюся окраску желтой полоски с цветной шкалой.
Примечания:
Для исследования использовать свеженабранную мочу, взятую до приема пищи.
На точность анализа отрицательно влияет присутствие в моче аскорбиновой кислоты.
Не дотрагивайтесь пальцами желтой полоски реактивной бумаги. Беречь от солнечных лучей и влаги!
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 13
Тема: «КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА НАЛИЧИЕ
ФЕНИЛПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ В МОЧЕ».
Накопление фенилпировиноградной кислоты в организме (в крови, в тканях) и наличие фенилпировиноградной кислоты в моче связаны с отсутствием у детей в печени фермента 4-фенилаланингидроксилазы. При этом фенилаланин не гидроксилируется и не превращается в тирозин. Накопление фенилаланина и продуктов его аномального распада, в частности фенилпировиноградной кислоты, в крови и тканях приводит к нарушению нормального развития мозга и появлению тяжелых нарушений психики ребенка. Доказательством данного наследственного заболевания – фенилпировиноградной олигофрении (слабоумия) – служит выявление повышенного содержания фенилаланина в крови (10-40 мг%) и наличие фенилпировиноградной кислоты в моче.
Метод основан на способности енольной формы фенипировиноградной кислоты образовывать с ионами трехвалентного железа комплексное соединение, окрашенное в сине-зеленый цвет.
ИСЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ: Моча.
РЕАКТИВЫ: 1) Серная кислота, 5 Н раствор. 2) Хлорид железа (III) FeCl3, 10%-ный раствор.
ОБОРУДОВАНИЕ: 1) Капельницы. 2) Пробирки. 3) Фильтры. 4) Пипетки на 5 мл.