95.Способы иммобилизации ферментов

Иммобилизация- включение фермента в такую среду, в которой для него доступной оказывается лишь ограниченная часть общего объема. Для иммобилизации ферментов используют рутинные физические и химические методы. Физической иммобилизация (фермент не соединяется с носителем ковалентными связями), 4 основные группы:

1) адсорбция на поверхности нерастворимого носителя

2) включение в поры геля;

3) пространственное разделение фермента от остальной части реакционной смеси с помощью полупроницаемой мембраны;

4) введение фермента в двухфазную реакционную среду, в которой он растворим, но может находиться только в одной из фаз.

1) Носителями иммобилизации могут быть как органические, так и неорганические вещества (в виде порошка, мелких гранул или шариков). Иммобилизация ферментов путем адсорбции на нерастворимых носителях (легкость регенерации и возможность придания им любой конфигурации): простота и достигается путем обеспечения контакта водного раствора фермента с избранным носителем. После отмывки неадсорбированного фермента препарат готов к применению. Для иммобилизации ферментов используются различные типы неорганических носителей: на основе силикагеля, глины, керамик, природных минералов, металлов и их оксидов.

Более пригодными для пром. использования могут оказаться природные алюмосиликаты - глины, а также пористая керамика, в состав которой, помимо алюмосиликатов, входят окислы титана, циркония или другие добавки.

Носителями на основе металлов и их оксидов, которые характеризуются: высокой мех. прочность, относительной дешевизна, стабильность и хорошие гидродинамические св.

2) Иммобилизация путем включения в гели (молекулы фермента включаются в трехмерную сетку, образованную тесно переплетающимися нитями (цепями), формирующими гель. Пространство между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой приходится обычно значительная часть общего объема геля). Для иммобилизации фермента в геле существует 2 основных способа:

а) фермент вводится в водный раствор мономера, проводят полимеризацию- формируется гель с включенными в него молекулами фермента;

б) фермент вносится в раствор готового полимера, который переводят в требуемое состояние, гелеобразное состояние.

3) включение в полупроницаемые мембраны -водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой мембраной, способной легко пропускать небольшие молекулы субстрата, задерживая крупные молекулы фермента. Существующие модификации этого метода (микрокапсулирование; метод двойного эмульгирования, в соответствии с которым приготовленная заранее эмульсия водного раствора фермента в органическом растворе полимера вновь диспергируется в воде).

В мед-х целях и нек-х исследованиях широко используется метод иммобилизации ферментов путем их включения в липосомы, такие системы близки природным мембранам и дают ценную информацию о ферментативных процессах, протекающих в клетках. Недостаток всех мембранных систем: невозможность ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов, для которых мембраны представляют собой непреодолимые барьеры.

Химические методы иммобилизации ферментов

Главные отличительные признаки: в молекуле фермента возникают новые ковалентные связи, между ферм. и носителем.

Дост-ва препаратов, при хим.иммобил.:

1)формирующаяся ковалентная связь между ферментом и носителем обеспечивает высокую прочность образующихся конъюгатов.

2) изменение св-в фермента(субстр. специфичности, каталит. активности и стабильности).

Исп-т неорганические носители (керамика, стекло, железо, цирконий и титан) или природные полимерами (сефароза и целлюлоза), синтетические (нейлон, полиакриламид).

Основные требования, предъявляемые к материалам, которые могут служить для иммобилизации ферментов:

1) высокая химическая и биологическая стойкость;

2) высокая механическая прочность;

3) достаточная проницаемость для фермента и субстратов, большая удельная поверхность, высокая пористость;

4) возможность получения трубок, листов и т. п.;

5) легкая активация (переведение в реакционноспособную форму);

6) высокая гидрофильность, позволяющая проводить реакции связывания с ферментом в водной среде;

7) невысокая стоимость.

Используемые в настоящее время органические носители можно разделить на два типа: 1 - природные полимеры, 2 — синтетические полимерные носители.

Природные полимеры: доступность и наличие св-х функциональных групп, легко вступающих в разнообразные химические реакции, выс. гидрофильность. Недост-ки:неустойчивость к воздействию некоторых микроорганизмов и относительно высокую стоимость многих из них. (целлюлоза, декстран, агароза и их производные).

Синтетические полимеры используются для иммобилизации ферментов различными способами, а также для получения гелей и микрокапсул.

Полиамидные носители (с повторяющейся амидной группировкой). Дост-во: могут быть созданы в различной физической форме: в виде гранул, порошков, волокон, мембран, трубок и т. п.