122. Клеточные генетические структуры способные выполнять роль векторов

Первые векторы для клонирования фрагментов чужеродной ДНК были получены с использованием бактериальных плазмид. Большая серия векторных плазмид, обозначенных символом pBR , создана на основе репликона природной плазмиды ColEI , придающей клеткам E. coli устойчивость к колицину путем его объединения с генами устойчивости к антибиотикам. Бактериальные клетки, несущие подобные комбинированные плазмиды, приобретали устойчивость к соответствующим антибиотикам, и их было легко отличить от бесплазмидных клеток путем простого посева на питательную среду с антибиотиками.

Векторы серии pBR322

Плазмида представляет собой кольцевую ковалентно замкнутую молекулу ДНК длиной 4363 п.о. Последовательность нуклеотидов pBR322 полностью известна. Плазмида содержит гены устойчивости к тетрациклину (Tc) и ампициллину (Ap) , которые были перенесены в плазмиду pBR322 из плазмиды pSC101 и транспозона Tn3 соответственно. Оба этих гена являются селектируемыми генетическими маркерами плазмиды, т.е. позволяют проводить отбор бактериальных клеток с плазмидой pBR322 по их способности к росту на питательных средах в присутствии тетрациклина и (или) ампициллина.

Векторы плазмидные: недостатки

Основным недостатком плазмидных векторов для клонирования является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Размер вставок клонируемой ДНК в плазмидных векторах, которые способны стабильно в них существовать, как правило, не превышает нескольких тысяч пар оснований.

Векторы сконструированные на основе хромосомы бактериофага λ обладают существенными преимуществами перед плазмидными векторами:

1. Они обладают значительно большей ёмкостью. В них можно клонировать ДНК длинной от 5 до 10 т. п. о.

2. Фаговые частицы, содержащие упакованную ДНК, способны проходить литический цикл развития внутри бактериальных клеток. => образуются бляшки на газоне. Каждая бляшка возникает в результате развития индивидуальной фаговой частицы, которая содержит рекомбинантную ДНК только одного типа, при этом в этой бляшке будут находиться искомые ферменты или последовательности нуклеотидов. Всё это помогает идентифицировать клонированные последовательности ДНК.

Космиды. Фаговые векторы позволяют клонировать фрагменты от 15 до 25 т. п. о., но этого не достаточно для генов животных и растений, длинна которых превышает 35-40 т. п. о.. Такой ёмкостью обладают космиды. Это небольшие плазмиды в которые in vitro введены cos-сайты ДНК б/ф λ. Наличие cos-сайтов ДНК является необходимым условием упаковываемости ДНК в фаговые частицы. => последовательность нуклеотидов фагового генома может быть замещена in vitro на аналогичный фрагмент чужеродной ДНК и упакована в фаговые частицы. Такая фаговая частица нежизнеспособна, однако после адсорбции химерной фаговой частицы на поверхность клетки, её ДНК проникает внутрь бактерии и начинает автономно реплицироваться как плазмида. Внутри клонируемого фрагмента есть гены устойчивости к антибиотикам. => такие бактерии можно селектировать на среде.

Фазмиды

Содержат в себе ген элементы плазмид и хромосом б/ф ёмкостью характеризующейся для λ-векторов – 15 т п о., они могу существовать в виде плазмид в клетке в определённых условиях, и сразу упаковываются в фаговые частицы при изменении этих условий.

Векторы на основе вирусов животных

Вирус SV-40. Развиваются в клетках обезьяны

Вирус осповакцины. Обладает двунитевой ДНК, которая имеет уникальное строение. Это линейная молекула на обоих концах которой имеются шпильки, замыкающие ковалентно обе нити ДНК.

Ретровирусы. Обладают однонитевой РНК. Их жизненный цикл обязательно проходит через образование двуцепочечной ДНк