131.Свойства нитевидных фагов, позволяющие им выступать в качестве векторов

Э. Коли. При клонировании и амплификации в векторных плазмидах или производных фага лямбда чужеродные фрагменты ДНК находятся в двухцепочечной форме. Однако в ряде случаев, например при направленном мутагенезе, необходимо манипулировать с одной цепью ДНК. При этом приходится разделять цепи ДНК, что не всегда просто. Поэтому клонирование ДНК в одноцепочечных векторах является привлекательным объединением процедур изолирования целевой последовательности ДНК, ее амплификации и разделении цепей исходного двуцепочечного фрагмента. Нитевидные фаги Э. Коли (М13, fd, fl) наиболее подходят для этой цели. Длинные, тонкие и гибкие вирионы этих фагов представляют собой кольцевую, одноцепочечную ДНК. Простая организация – небольшой размер генома(максимум 8 генов). Высока плодовитость. Непостоянство размеров.

132. Векторы на основе генома нитевидных фагов.

С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т.п.н. Однако при создании геномных библиотек часто приходится работать с более крупными фрагментами. Для этого были разработаны векторы на основе бактериофага λ Escherichia coli.

После проникновения фага λ в клетку Escherichia coli события могут развиваться по двум сценариям. Если реализуется литический цикл, то фаг начинает интенсивно размножаться и примерно через 20 мин. клетка разрушается (лизируется) с высвобождением до 100 новых фаговых частиц. При альтернативном варианте развития событий фаговая ДНК включается в хромосому Escherichia coli как профаг и реплицируется в клетке вместе с нормальными бактериальными генами.

В результате исследований по изучению сборки фага λ была разработана система упаковки малекул ДНК in vitro с образованием инфекционных фаговых частиц. Смешав в пробирке очищенные пустые головки, фаговую ДНК и собранные отростки, можно получить инфекционные фаговые частицы.

133. Особенности тарансформации грамотрицательных и грамположительных бактерий

134.Векторы для клонирования в грамположительных бактриях

135. Челночные векторы (бинарные)

Интегрирующая плазмида pFH7 получена путем объединения 2 репликонов, один из которых берет начало от плазмиды pC194 B.subtilis, а другой от плазмиды pBR322 E.coli, что дает возможность вектору существовать стабильно реплицироваться как в клетках B.subtilis, так и E.coli. Такие векторы, способные реплицироваться в клетках-хозяевах разных биологических видов, называют челночными или бинарными. Принципы конструирования и функционирования челночных векторов одинаковы, они должны включать в себя репликоны тех генетических систем, в которых будет происходить репликаця челночного вектора.

Примерами челночных векторов являются плазмидные ДНК, способные реплицроваться в клетках высших (жив. и растений) и низших организмов. Необходимость использования челночных векторов в генной инженерии связана с тем, что наработку в препаративном количестве векторной ДНК для проведения генно-инженерных манипуляций удобно проводить в бактериальных клетках, тогда как получение биологически активных продуктов клонированных генов высших организмов во многих случаях возможно только в клетках своего или близкого вида, в которых эти гены экспрессируются в природных условиях, т.е. в своем обычном генетическом окружении.