123. Принципы конструирования векторов.

Конструирование клонирующих векторов подразумевает встраивание или удаление удобных для идентификации клонов генетических элементов (специфических сайтов рестрикции, инициации и регуляции транскрипции). Например, при создании плазмидных клонирующих векторов ослабляют систему контроля репликации и добавляют или вырезают гены антибиотикоустойчивости. При формировании фаговой векторной конструкции экзогенную ДНК встраивают в район локализации маркерного гена, позволяющего вести селекцию химерных фагов по экспрессии химерного белка (часть полипептидной цепи соответствует маркерному белку, а часть -информации, заключенной во встроенном фрагменте ДНК). Определение химерного белка возможно при использовании антител к фрагменту маркерного белка или участку, кодируемому чужеродной ДНК, а также путем выявления функционально активного белка после протеолитического расщепления химерного полипептида. При конструировании искусственных дрожжевых хромосом YAC (от англ. yeast artificial chromosomes) используют плазмидные векторы, содержащие в своем составе известные центромерные и теломерные последовательности хромосом дрожжей, необходимые для поддержания репликации векторов в клетках хозяина. Характеристики клонирующих векторов представлены в таблице.

124. Требования к идеальному плазмидному вектору.

Для введения в клетки бактерий чужеродных ДНК необходимо наличие так называемого клонирующего вектора, т.е. автономно реплицирующегося в клетках фрагмента ДНК. Большая часть известных векторов сконструирована ан основе имеющихся в клетках бактерий внехромосомальных элементов типа плазмид или бактериофагов. При их создании и использовании придерживаются следующих критериев:

• вектор должен быть небольшим в связи с тем, что эффективность трансформации клеток-хозяев снижается по мере увеличения размера плазмиды до 15 тыс. пар нуклеотидов (т.п.н.) и выше;

• вектор должен быть хорошо охарактеризован относительно числа генов и их расположения, а также сайтов рестрикции и нуклеотидной последовательности;

• вектор должен легко реплицироваться в клетке-хозяине;

• вектор должен иметь один или несколько селективных маркеров (генов), позволяющих легко отличать клетки, несущие вектор, от нетрансформированных клеток;

• идеальный вектор должен дополнительно содержать маркер, который может быть активирован или инактивирован путем встраивания фрагментов гетерологичной ДНК;

• вектор должен содержать максимальное число уникальных сайтов рестрикции, в которые может быть осуществлена вставка гетерологичной ДНК.

125. Свойства фага с точки зрения вектора для создания рекомбинантных молекул.

С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т. п. н. Однако при создании геномных библиотек часто приходится работать с более крупными фрагментами. Для этого были разработаны векторы на основе бактериофага λ Ε. coli.

Инфекционная фаговая частица имеет головку, в которой заключена плотно упакованная ДНК длиной примерно 50 т. п. н., и отросток с отходящими от него тонкими белковыми нитями (фибриллами). Сборка головки и отростка и упаковка ДНК четко скоординированы. ДНК фага λ — это линейная двухцепочечная молекула длиной 50 т. п. н. с одноцепочечными 5'-«хвостами» из 12 нуклеотидов. Их называют липкими (cos) концами, поскольку они взаимно комплементарны и могут спариваться друг с другом. После того как фаговая ДНК проходит через отросток и попадает в E. coli, cos-концы соединяются с образованием кольцевой молекулы. На раннем этапе литического цикла в результате репликации кольцевой молекулы ДНК образуется линейная молекула, состоящая из нескольких сегментов длиной 50 т. п. н. Каждый из таких сегментов упаковывается в белковую головку, к последней присоединяется уже собранный отросток и образуется новая фаговая частица. При упаковке молекулы ДНК длиной менее 38 т. п. н. получается неинфекционная фаговая частица, а фрагменты длиной более 52 т, п. н. не умещаются в головку. Сегменты длиной 50 т. п. н. в линейной молекуле ДНК разделены cos-сайтами, и именно по этим сайтам разрезается молекула, когда очередной сегмент заполняет головку. Разрезание осуществляет фермент, находящийся у входа в головку.

В результате исследований по изучению сборки фага λ была разработана система упаковки молекул ДНК in vitro с образованием инфекционных фаговых частиц. Смешав в пробирке очищенные пустые головки, фаговую ДНК и собранные отростки, можно получить инфекционные фаговые частицы.