141. Организация и «поведение» Ti- плазмиды.

Ti-плазмида-плазмида почвенной бактерии Agrobacterium tumefaclens, Т-участок которой способен включаться в ядерную ДНК, приводит к образо-ванию опухолей. Т-ДНК (от англ, transferred DNA). Т-ДНК — это часть плазмиды, индуцирующей развитие опухоли (tumor-inducing plasmid, Ti-плазмиды); ее несут большинство штаммов A. Tumefaciens.

После присоединения A. tumefaciens, несущей Ti-плазмиду, к растительной клетке и активации νir-генов Т-ДНК транспортируется в клетку, по-видимому, с помощью механизма, аналогичного механизму переноса плазмидной ДНК из донорной клетки в реципиентную в процессе конъюгации. При этом Т-ДНК находится в одноцепочечной форме, и именно в такой форме она встраивается в хромосомную ДНК растения.

Было сконструировано несколько векторов для растительных клеток. Все векторы на основе Ti-плазмид организованы сходным образом и имеют следующие элементы.

•   Селективный маркерный ген, например ген неомицинфосфотрансферазы, который обеспечивает устойчивость трансформированных растительных клеток к канамицину.  Поскольку этот ген (как и многие другие маркерные гены, используемые при трансформации растений) по своей природе прокариотический, необходимо поставить его под контроль растительных (эукариотических) сигналов регуляции транскрипции, в том числе промотора и сигнала терминации-полиаденилирования. Это обеспечит эффективную экспрессию гена в трансформированных растительных клетках.

•   Сайт инициации репликации, который позволяет плазмиде реплицироваться в E. coli. Некоторые векторы содержат также и сайт инициации репликации A. tumefaciens.

•   Правая фланкирующая последовательность Т-ДНК. Этот элемент абсолютно необходим для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений. Большинство же векторов содержат как правую, так и левую фланкирующие последовательности.

•   Полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гена в участок между границами Т-ДНК.

143. Стратегия клонирования в грамположительных бактериях

В наст.время разработаны стратегии клонирования в бактериях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Особый интерес с экономической точки зрения пр-т системы клонирования в грамположительных бактериях, многие из которых являются сверхпродуцентами важнейших химических соединений. Значительных успехов в биоиндустрии удалось достичь с клетками B.subtilis, стрептомицетами и Saccharomyces cerevisiae. Векторы для клонирования в таких системах пр-т собой двойные репликоны, способные существовать и в клетке E.coli, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-л из плазмид E.coli и требуемый репликон (из дрожжей, бактерий и др.) и первоначально клонируют с последующим отбором требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем выделенные рекомбинантные вводят в новый организм. Такие векторы должны содержать ген (или гены), придающей клетке-хозяину легко тестируемый признак.

B.subtilis- непатогенный почвенный микроорганизм. Клеточная стенка бактерии содержит простую структуру, позволяющую секретировать многие белки в культуральную жидкость. В частност, 20 различных видов бактерий синтезирует более 40 ферментов с внеклеточной локализацей. В этих бациллах обнаружены плазмиды и фаги. Клонирование осущетвляется с помощью челночных векторов, которые способны реплицироваться в клетках нескольких хозяев: B.subtilis, E.coli. Векторы были получены комбинацией in vitro в пробирке фрагментов плазмид E.coli и хромосомных фрагментов B.subtilis. Полученные рекомбинантные штаммы несут прзнаки устойчивости к антибиотикам.

Стрептомицеты широко применяют в биотехнологии в качестве продуцентов антибиотиков. Конструирование векторов для клонирования в них началось с выделения плазмиды Scp22 из Streptomyces coelicolor. На основе этой плазмиды были сконструированы векторы, придающие стрептомицетам устойчивость к антибиотикам, например к метиломицину А.