149. Сложная структура организации эукариотических генов и их экспрессия в прокариотических клетках.

У эукариотических организмов механизм регуляции транскрипции гораздо более сложен. В результате клонирования и секвенирования генов эукариот обнаружены специфические последовательности, принимающие участие в транскрипции и трансляции.

Для эукариотической клетки характерно:

1. Наличие интронов и экзонов в молекуле ДНК.

2. Созревание и-РНК - вырезание интронов и сшивка экзонов.

3. Наличие регуляторных элементов, регулирующих транскрипцию, таких как:

а) промоторы - 3 вида, на каждый из которых садится специфическая полимераза. Pol I реплицирует рибосомные гены, Pol II - структурные гены белков, Pol III - гены, кодирующие небольшие РНК. Промотор Pol I и Pol II находятся перед участком инициации транскрипции, промотор Pol III - в рамках структурного гена;

б) модуляторы - последовательности ДНК, усиливающие уровень транскрипции;

в) усилители - последовательности, усиливающие уровень транскрипции и действующие независимо от своего положения относительно кодирующей части гена и состояния начальной точки синтеза РНК;

г) терминаторы - специфические последовательности, прекращающие и трансляцию, и транскрипцию.

Эти последовательности по своей первичной структуре и расположению относительно инициирующего кодона отличаются от прокариотических, и бактериальная РНК-полимераза их не "узнает". Таким образом, для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот нужно, чтобы гены находились под контролем прокариотических регуляторных элементов. Это обстоятельство необходимо учитывать при конструировании векторов для экспрессии.

150. Получение продуцента человеческого гормона роста

Синтетический олигонуклеотид (начальный участок: 1–24 аминокислота) ↓ Промотер lag (зИК 322) ↓ ↓	Гипофиз человека из свежего трупа ↓ мРНК ↓обратная транскрипция кДНК ↓ 25–191 аминокилота ↓
Трансформация (E.coli) ↓ Продукция гормона роста человека

151. К-ДНК, получение и сферы применения

К-ДНК- однонитевая ДНК, синтезированная in vivo по РНКовой матрице с помощью обратной транскриптазы.

К-ДНК играют важную роль в исследованиях по молекулярной биологии эукариот. Они пр-т собой гены без интронов, необходимые для экспрессии эукариотических генов в бактериях, а также для получения информации о кодирующей части гена (кДНК регуляторных элементов генов. Анализ кДНК применяют для изучения клеток, по какой-л причине меняющих активность генов. Часто к ДНК служат также зондами (синтетические олигонуклеотиды определенной длины, которые комплементарны отыскиваемому гену). Например, если в геномном банке нужно найти методом гибридизации клон с заданным геном, а специфичная мРНК пр-на в малом количестве, то сначала синтезируют кДНК, клонируют ее, метят и используют для скрининга.

Банком кДНК называют коллекцию ДНК- копий мРНК клеток конкретной ткани на определенной стадии развития организма. Редкие мРНК определяют какое число клонов кДНК необходимо отобрать, чтобы банк был представительным. Успех синтеза кДНК зависит от качества выделенной суммарной мРНК.

Небольшой размер кДНК позволяет вести ее клонирование в плазмидных векторах, но для получения банков используют λ векторы, что облегчает хранение рекДНК.

153.Способы введения клонируемой ДНК в клетки бактерий. (С помощью вирусов.) Необходимый этап генно­инженерноrо эксперимента ­ введение полученных in vitro гибридных молекул ДНК в пермиссивные клетки (обеспечивающие репликацию этих молекул) с целью размножения, селекции и выделения клонов гибридов. Введение в клетку нуклеиновой кислоты ви­руса с последующим образованием вирусного потомства называется трансфекцией, Эффек­тивность трансфекции выражается обычно ко­личеством инфекционных центров (бляшек, He­гативных колоний), приходящихся на молекулу или на единицу массы нуклеиновой кислоты вируса. Вирусные клоны, полученные после трансфекции из отдельных бляшек, называют трансфектантами.