- •Введение
- •История развития микробиологии.
- •Глава 1. Место микроорганизмов среди других живых существ. Классификация и систематика.
- •Глава 2. Морфология микроорганизмов.
- •Глава 3. Методы микроскопического исследования микробов.
- •Глава 4. Физиология микроорганизмов
- •Глава 5. Методы культивирования микроорганизмов. Изучение культуральных и биохимических свойств.
- •Глава 6. Общая вирусология.
- •Глава 7. Бактериофаги и бактериофагия.
- •Глава 8. Экологическая микробиология (микроэкология).
- •Глава 9. Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы.
- •Глава 10. Генетика микроорганизмов
- •Глава 11. Антибиотики.
- •Глава 12. Микрофлора организма человека
- •Глава 13. Инфекция
- •Глава 14. Иммунитет
- •Антигены
- •Иммунный ответ (иммуногенез)
- •Аллергия
- •Реакции иммунитета
- •Диагностические препараты
- •Лечебные и профилактические препараты
- •Иммунные сыворотки и иммуноглобулины
- •Часть вторая. Частная микробиология
- •Стафилококки
- •Стрептококки
- •Пиогенные (гноеродные) стрептококки
- •Скарлатинозный стрептококк
- •Пневмококки
- •Энтерококки
- •Менингококки
- •Гонококки
- •Семейство кишечных бактерий
- •Эшерихии
- •Сальмонеллы
- •Сальмонеллы - возбудители брюшного тифа и паратифов
- •Шигеллы
- •Холерный вибрион
- •Кампилобактеры
- •Хламидии
- •Возбудители вирусных заболеваний
Реакции иммунитета
В Основе реакций иммунитета лежит специфическое взаимодействие между антигеном и антителами. Реакции происходят в том случае, если антиген и антитела соответствуют, специфичны друг для друга. Следовательно, реакции иммунитета можно использовать в двух направлениях: 1)с помощью известных антигенов определить наличие антител в сыворотке крови больного и 2)с помощью известных антител, которые содержатся в иммунной сыворотке, определить вид и тип микроорганизма.
Поскольку в реакциях иммунитета участвует сыворотка, их называют серологическими (лат. serum - сыворотка).
Процесс взаимодействия антигена и антитела происходит в две фазы. Первая фаза - это специфическое соединение антигена и антител, вторая - неспецифическая, видимая фаза, происходит обычно в присутствии электролитов. Видимое проявление зависит от антигена: если это корпускулярный антиген, например, микробы, то образуются хлопья (агглютинация), если антиген растворимый (молекулярно-дисперсный), например, белки или полисахариды, то образуется осадок (преципитация).
Реакция нейтрализации токсина антитоксином
В этой реакции антигеном является экзотоксин, антителами - антитоксины. При их взаимодействии происходит нейтрализация токсина. Реакцию ставят в пробирках для определения силы антитоксической сыворотки. Внешнее проявление реакции - флоккуляция (помутнение).
Для обнаружения токсина с диагностической целью при ботулизме, столбняке, газовой анаэробной инфекции ставят реакцию нейтрализации токсина антитоксином в биологическом опыте на животных.
Реакция агглютинации
Реакция агглютинации - склеивание бактерий под влиянием специфических антител. Реакция протекает в две фазы. В первойфазе происходит специфическое присоединение антител к поверхности клетки, во второй - образование хлопьев в присутствии электролита (хлорида натрия). Видимая реакция происходит в том случае, если антитела имеют два активных центра, к каждому их них присоединяется антиген, и в результате образуется "решетка".
Методы постановки реакции агглютинации:
1)развернутая реакция агглютинации ставится в пробирках с последовательными разведениями сыворотки;
2)реакция агглютинации на предметном стекле в капле сыворотки, разведенной 1:5 - 1:10; наступает в течение нескольких минут.
Для определения антигенной структуры микробов, выделенных из организма пациента, используют а г г л ю т и н и р у ю щ у ю с ы в о р о т к у, полученную из крови животного (кролика, барана), иммунизированного этими микробами. Титром диагностической агглютинирующей сыворотки называется наибольшее ее разведение, которое вызывает агглютинацию.
Если агглютинирующая сыворотка содержит антитела против Н-антигена, то подвижные бактерии склеиваются своими жгутиками, образуются рыхлые хлопья. Это крупнохлопчатая агглютинация, наступающая быстро - в течение двух часов.
Сыворотка, содержащая О-агглютинины, вызывает тонкозернистую агглютинацию в течение 18-24 часов.
Агглютинирующие сыворотки, полученные путем иммунизации животных микробами, могут содержать антитела против родственных микробов, то есть являются поливалентными. Для повышения специфичности сывороток из них удаляют групповые антитела методом адсорбции по Кастелляни, с помощью групповых антигенов. Полученные сыворотки называют адсорбированными. Оставляя антитела только к одному антигену, получают монорецепторные сыворотки. С такими сыворотками ставят реакцию агглютинации на стекле, которая в этом случае не является ориентировочной.
Для обнаружения антител в сыворотке крови пациента в качестве известного антигена используют убитые культуры микробов, так называемые д и а г н о с т и к у м ы. При постановке серологического диагноза учитывают диагностический титр сыворотки
- для большинства заболеваний 1:100 или 1:200.
Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации
Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) более чувствительна и специфична, чем реакция агглютинации. Эту реакцию также используют в двух направлениях:
1)Для обнаружения антител в сыворотке крови больного применяются эритроцитарные диагностикумы, в которых антиген адсорбирован на поверхности обработанных танином эритроцитов. В отношении этой реакции чаще употребляют термин РПГА.
Исследуемую сыворотку разводят в лунках пластмассовых пластин и добавляют эритроцитарный диагностикум. При положительной реакции появляется тонкая пленка по стенкам лунки в виде "кружевного зонтика", при отрицательной реакции - плотный осадок эритроцитов в виде "пуговки".
2)Для обнаружения токсинов и бактериальных антигенов в исследуемом материале применяют антительные эритроцитарные диагностикумы, полученные путем адсорбции антител на эритроцитах. В отношении этой реакции чаще употребляется термин РНГА. Например, с помощью антительных диагностикумов обнаруживают антиген палочки чумы, дифтерийный экзотоксин, ботулинический экзотоксин.
Реакция Кумбса (антиглобулиновый тест)
Реакцию применяют для выявления неполных антител, например, антител к резус-фактору. К Rh+ эритроцитам добавляют исследуемую сыворотку, в которой предполагается присутствие неполных антител к резус-фактору. Присоединившись к эритроцитам, неполные антитела не вызывают агглютинации, так как имеют только один активный центр. Затем добавляют антиглобулиновую сыворотку, содержащую антитела к глобулинам человека. Соединившись с неполными антителами, антиглобулиновая сыворотка вызывает агглютинацию эритроцитов.
Реакция преципитации
Сущность реакции состоит в осаждении (преципитации) антигена под действием специфических антител. Для получения видимой реакции необходимо присутствие электролита. Антигеном в реакции преципитации являются молекулярно-дисперсные вещества.
Реакция кольцепреципитации ставится в узких преципитационных пробирках. В пробирку наливают иммунную сыворотку, на нее осторожно наслаивают исследуемый материал. При наличии в нем антигена на границе двух жидкостей образуется непрозрачное кольцо преципитата.
Реакцию применяют в судебной медицине для определения видовой принадлежности белков в кровяных пятнах, в сперме и т.д.; для определения антигена при диагностике сибирской язвы (реакция Асколи), менингита и других инфекций; в санитарно-гигиенических исследованиях - для установления фальсификации пищевых продуктов. Иммунные преципитирующие сыворотки получают путем иммунизации животных соответствующим антигеном. Например, сыворотка, преципитирующая белок человека, получена путем иммунизации кролика белком человека. Титр преципитирующей сыворотки - это наибольшее разведение антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5.
Реакция преципитации в геле агара проводится несколькими методами. Это реакция двойной иммунодиффузии, реакция радиальной иммунодиффузии, реакция иммуноэлектрофореза.
Р е а к ц и я д в о й н о й и м м у н о д и ф ф у з и и ( п о О у х т е р л о н и ). Растопленный агаровый гель выливают в чашку Петри и после затвердения в нем вырезают лунки. В одни лунки помещают антиген, в другие - иммунные сыворотки, которые диффундируют в агар, образуют в месте встречи преципитат в виде белых полос.
Р е а к ц и я р а д и а л ь н о й и м м у н о д и ф ф у з и и ( п о М а н ч и н и ). В растопленный агаровый гель вносят иммунную сыворотку, выливают в чашку. После застывания агара в нем вырезают лунки и помещают в них антигены, которые, диффундируя в агар, образуют кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Чем выше концентрация антигена, тем больше диаметр кольца. Реакцию применяют, например, для определения в крови иммуноглобулинов различных классов. Иммуноглобулины классов IgG, IgM, IgA действуют в этой реакции как антигены, а антитела против них содержатся в специфических монорецепторных сыворотках.
Иммуноэлектрофорез. В агаровом геле проводят электрофорез белковых антигенов. В канавку, которая идет параллельно направлению движения белков, вносят преципитирующую сыворотку. Антигены и антитела диффундируют в агар, и в месте их встречи образу-
ются линии преципитации.
Реакции иммунного лизиса
Антиген (эритроциты или бактерии), соединившись со специфическими антителами, образует иммунный комплекс, к которому присоединяется комплемент (С1), и происходит активация комплемента по классическому пути. Активированный комплемент лизирует эритроциты (гемолиз) или бактерии (бактериолиз). Реакция бактериолиза применяется для идентификации холерного вибриона.
Реакция гемолиза. Антигеном в реакции служат эритроциты, антитела (гемолизины) содержатся в гемолитической сыворотке. Гемолизины присоединяются к эритроцитам, происходит активация комплемента, который лизирует эритроциты. Мутная взвесь эритроцитов превращается в прозрачную ярко-красную жидкость - "лаковую кровь". Поскольку реакция гемолиза происходит только в присутствии комплемента, ее применяют как индикаторную для обнаружения комплемента.
Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) - вариант реакции гемолиза. Служит для определения количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и лимфатических узлах.
Растопленный агаровый гель смешивают с суспензией клеток селезенки и эритроцитами и после застывания агара добавляют комплемент. Вокруг каждой клетки, продуцирующей гемолизины, образуется зона гемолиза. По числу таких зон определяют количество клеток, продуцирующих гемолизины.
Реакция связывания комплемента
Реакция связывания комплемента (РСК) ставится в две фазы: в первой фазе антиген соединяют с исследуемой сывороткой, в которой предполагают наличие антител, и добавляют комплемент, инкубируют в термостате 30 минут или 18-20 часов в холодильнике.
Вторая фаза: добавляют гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате в течение 30 минут учитывают результат.
При положительной РСК антитела сыворотки, соединившись с антигеном, образуют иммунный комплекс, который присоединяет к себе комплемент, и гемолиза не произойдет. Если реакция отрица-
тельная (антител в исследуемой сыворотке нет), комплемент останется свободным, и произойдет гемолиз.
РСК применяется для серологической диагностики сифилиса, гонореи, сыпного тифа и других заболеваний.
РСК можно применять для определения антигена, например, вируса. В этом случае в качестве антител применяется диагностическая иммунная сыворотка.
В качестве комплемента для РСК применяется сыворотка крови морской свинки. Гемолитическую сыворотку получают из крови кроликов, иммунизированных эритроцитами барана.
Реакции с участием меченых антигенов или антител
Реакции основаны на использовании меченых иммунореагентов. Помечены могут быть антигены, антитела или антиглобулиновая сыворотка. В качестве метки используют флюоресцентные красители (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электронноплотные соединения (ИЭМ).
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакция Кунса. Это метод экспресс-диагностики. Для постановки РИФ применяются иммунные сыворотки, меченные флюорохромными красителями, например, изотиоцианатом флюоресцеина. Флюорохромы вступают в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их специфичности.
П р я м о й м е т о д Р И Ф. Из исследуемого материа-
ла, в котором предполагается наличие антигена (например, холерного вибриона), готовят препарат-мазок и обрабатывают его флюоресциирующей сывороткой, содержащей антитела к данному антигену (в нашем случае - противохолерной сывороткой). При микроскопии в люминесцентном микроскопе наблюдают светящиеся микробы.
Недостатком прямого метода РИФ является необходимость иметь большой набор флюоресциирующих сывороток против каждого антигена.
Н е п р я м о й м е т о д Р И Ф. Препарат-мазок обрабатывают иммунной кроличьей антисывороткой к антигену (противохолерной кроличьей сывороткой), а затем - флюоресциирующей антиглобулиновой сывороткой, содержащей антитела против глобулинов кролика. Затем наблюдают в люминесцентном микроскопе светящиеся микробы.При использовании этого метода можно иметь одну флюоресцирующую сыворотку против глобулинов кролика.
Иммуноферментный анализ. Как и другие реакции иммунитета, ИФА используется 1)для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2)для выявления антител в сыворотке крови больного с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединен с ферментом, и его присутствие определяется с помощью субстрата, который при действии фермента окрашивается.
Наиболее широко применяется твердофазный ИФА.
1) О б н а р у ж е н и е а н т и г е н а (Рис. 20). Первый этап - адсорбция специфических антител на твердой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей.
Второй этап - добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого луночки промывают.
Третий этап - добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченные ферментом. В качестве фермента используют пероксидазу или щелочную фосфатазу. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом материале антигена на поверхности твердой фазы образуется комплекс антитело-антиген-антитела, меченные ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилдиамин в смеси с Н2О2 в буферном растворе. При действии фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску, интенсивность которой позволяет количественно определить результаты опыта фотометрированием.
2) О б н а р у ж е н и е а н т и т е л (Рис. 21). Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках лунки. Обычно в коммерческих системах антигены уже адсорбированы на поверхности твердой фазы - в лунках или на пластиковых шариках.
Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитела.
Третий этап - после отмывания лунок добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против глобулинов человека), меченные ферментом.
Результаты реакции учитывают, как указано выше.В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные.Разрабатываются " б е з р е а г е н т н ы е " системы для ИФА, в которых все компоненты реакции соединены с поверхностью полимера. Для проведения анализа необходимо внести исследуемый материал и наблюдать изменение окраски.
ИФА применяется при многих инфекционных заболеваниях, в частности, при ВИЧ-инфекции, при вирусных гепатитах.
Иммуноблоттинг - это вариант ИФА, сочетание электрофореза и ИФА. Методом электрофореза в геле, содержащем ферменты, разделяют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита человека. Затем переносят разделенные молекулы на поверхность нитроцеллюлозы в том же порядке, в каком они находились в геле. Процесс переноса называется блоттинг, а полученный отпечаток - блот (англ. blot - пятно). На этот отпечаток действуют исследуемой сывороткой. Затем добавляют сыворотку против глобулинов человека, меченную пероксидазой. После этого добавляют субстрат, который под действием фермента приобретает коричневый цвет. Образуются коричневые полосы в тех местах, где антитела соединились с антигенами. Метод позволяет обнаружить антитела к отдельным антигенам вируса.
Радиоиммуннологический анализ (РИА). Метод позволяет определить не только наличие антигена в исследуемой пробе, но и его количество.
К иммунной сыворотке на первом этапе присоединяют исследуемый материал, предположительно содержащий антиген. На втором этапе добавляют известный антиген, меченный радиоизотопом, например, 125I. В результате происходит связывание определяемого (немеченого) и известного (меченого) антигена с ограниченным количеством антител. Так как меченый антиген добавляется в определенной дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая осталась свободной из-за конкуренции с немеченым антигеном и была удалена. Количество меченого антигена, связавшегося с антителами, определяют с помощью счетчика. Оно обратно пропорционально количеству определяемого антигена.
Широкое внедрение РИА затруднено из-за необходимости соблюдать правила работы с радиоактивным материалом.
Иммунноэлектронная микроскопия (ИЭМ). К антигену, например, к вирусу гриппа, присоединяют специфическую антисыворотку, меченную электронноплотным веществом. В качестве метки применяют
металлосодержащие белки (ферритин, гемоцианин), коллоидное золото. При непрямом методе к антигену присоединяют специфическую сыворотку, затем - антиглобулиновую меченую сыворотку.
При микроскопии в электронном микроскопе делают фотографии, на которых видны вирионы с присоединившимися к ним темными точками - молекулами меченых антител (Рис. 22 и 23).
Медицинские биологические препараты для диагностики, профилактики и терапии инфекционных болезней