Глава 3. Методы микроскопического исследования микробов.

Методы микроскопического исследования используют для изуче­ния формы и структуры клетки, подвижности микробов.

Микроскопия в световом, оптическом микроскопе.

Световой микроскоп состоит из механической и оптической части. Механическая часть микроскопа - это штатив, состоящий из основания и колонки, к которой прикреплены тубус и предметный столик. В колонке имеются две винтовые системы для установки ту­буса. Макрометрический винт служит для установки на фокус при слабых увеличениях (объектив х 8), а при сильных объективах ( х 40, х 90) - для первоначальной грубой установки. Для более точ­ной установки служит микрометрический винт. Это одна из наиболее хрупких частей микроскопа, и работа с ним требует особой осто­рожности.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного аппа­рата, объективов и окуляров.

Осветительный аппарат расположен под предметным столиком. В большинстве микроскопов свет отражается от зеркала и, пройдя че­рез линзы конденсора, фокусируется в плоскости препарата. В сов­ременных микроскопах освещение достигается с помощью вмонтиро­ванного в микроскоп источника света.

Объективы представляют собой систему линз в металлической оправе. Передняя (фронтальная) линза - самая маленькая. От нее главным образом зависит увеличение микроскопа. Расположенные за ней линзы называются коррекционными, так как они предназначены для устранения недостатков оптического изображения.

На оправе объективов обозначается создаваемое ими увеличе­ние: х 8, х 40, х 90. Объективы х 8 (малое увеличение) и х 40 - это сухие объективы. При работе с ними между фронтальной линзой объектива и препаратом находится воздух. При этом, вследствие разницы показателей преломления стекла (1,52) и воздуха (1,0), часть световых лучей, проходя через оптически неоднородные сре­ды, рассеивается. При микроскопии с объективами ^х 8 и ^х 40 это не имеет значения. Но микробы настолько малы, что для их иссле­дования необходимо более сильное увеличение, которое дает объек­тив ^х 90. При работе с этим объективом преломление света должно

быть устранено. Для этого между предметным стеклом и линзой по­мещают каплю жидкости, показатель преломления которой равен по­казателю преломления стекла. Более всего для этого подходит кед­ровое масло или его заменители. При микроскопии объектив погру­жают в каплю масла, поэтому объектив называют иммерсионной сис­темой (лат. immercio - погружение), а масло - иммерсионным мас­лом. Иммерсионный объектив требует особо осторожного обращения. Фронтальная линза имеет настолько короткое фокусное расстояние до исследуемого объекта, что опускать объектив нужно медленно, глядя сбоку, чтобы не раздавить препарат, что связано с порчей линзы.

Окуляры имеют две линзы: верхняя называется глазной - ниж­няя - собирательной. Окуляры обозначают по тому увеличению, ко­торое они дают, например: ^х 7, ^х 10, ^х 15. Чем больше увеличе­ние, тем меньше четкость изображения. Окуляр дает увеличение, ничего не добавляя в деталях изображения, данного объективом.

Чтобы определить общее увеличение микроскопа, нужно умно­жить увеличение объектива на увеличение окуляра.

Разрешающая способность светового микроскопа - это наимень­шее расстояние между точками в препарате, которые еще не слива­ются в изображение. Для светового микроскопа эта способность за­висит от длины волны видимого света, и предел разрешения опти­ческого микроскопа равен 0,2 мкм.

Изображение объекта в микроскопе увеличенное и обратное.

Правила микроскопии с иммерсионной системой.

Работать сидя.

Поднять конденсор до уровня предметного столика.

Глядя на верхнюю поверхность конденсора, осветить поле зре­ния.

Установить иммерсионный объектив.

На предметный столик поместить препарат с каплей иммерсион­ного масла.

Глядя сбоку, осторожно опустить тубус с помощью макровинта до соприкосновения объектива с маслом и чуть-чуть погрузить его в масло, не доводя до соприкосновения с предметным стеклом.

Глядя в окуляр, медленно поднимать макровинтом тубус до по­лучения изображения в поле зрения. Не разрешается опускать мак­ровинтом тубус, глядя в окуляр.

Микровинтом, вращая его не более чем вполоборота, найти яс-

ное изображение и рассматривать его. Держать оба глаза открыты­ми. Левой рукой передвигать препарат для общего обозрения. Если предметный столик подвижный, можно для более мелких и точных движений пользоваться боковыми винтами. Правой рукой слегка вра­щать микровинт, чтобы препарат всегда был в фокусе.

После просмотра препарата поднять тубус при помощи макро­винта, снять препарат, установить объектив ^х 8, вытереть мягкой салфеткой масло с иммерсионного объектива.

Микроскопия в темном поле. для микроскопии в темном поле применяются особые конденсоры, у которых центральная часть линзы затемнена, за исключением узкой полоски по периферии. Кроме то­го, боковые поверхности конденсора представляют собой не прямую линию, а параболу. Внутренняя поверхность такого темнопольного параболоид-конденсора зеркальная.

Лучи света попадают в темнопольный конденсор только через узкую полоску по периферии линзы. Затем они отражаются от его зеркальной поверхности и, если в поле зрения нет никакого объек­та, то ни один луч не попадает в объектив. Поле зрения кажется совершенно черным. Если же в поле зрения есть какие-то объекты, например, микробы, то лучи, отраженные от них, попадают в объек­тив, и их можно видеть светящимися на темном фоне (Рис. 4).

Это явление подобно тому, которое наблюдается в комнате с затемненными окнами, когда в косых лучах света, проникающих че­рез щель, видны танцующие пылинки, при обычном освещении невиди­мые (феномен Тиндаля).

За неимением специального темнопольного конденсора можно обычный конденсор превратить в темнопольный, поместив между его линзами кружок черной бумаги, немногим меньше по диаметру линзы конденсора. В таком "приспособленном" конденсоре можно наблюдать достаточно ясно живых светящихся микробов, но поле зрения будет не черным, а серым.

Преимущество микроскопии в темном поле зрения состоит в том, что при этом можно видеть объекты более мелкие. Кроме того, в темном поле зрения лучше наблюдать в живом состоянии такие микробы, как лептоспиры, которые в водной среде не преломляют света и поэтому в проходящем свете совершенно прозрачны.

Фазовоконтрастная микроскопия. Проходя через непрозрачные объекты, такие как окрашенные препараты микроорганизмов, свето­вые волны ослабляют величину амплитуды. Такие изменения, называ-

емые амплитудными, улавливаются человеческим глазом. Поэтому ок­рашенные микробы видны в обычном микроскопе.

Объекты, разные по плотности, но одинаковые по прозрачнос­ти, не меняют амплитуды световых волн, а только изменяют фазу (фазовые объекты). Такие фазовые изменения не улавливаются чело­веческим глазом. Поэтому живые клетки микробов, их структурные элементы в живом состоянии прозрачны для видимого света.

Фазово-контрастный микроскоп превращает фазовые изменения в амплитудные. Поэтому структурные элементы с различной плотностью выглядят как более светлые и более темные. Это позволяет наблю­дать не только фазовые объекты целиком, но и структурные элемен­ты микробов.

Фазово-контрастная микроскопия осуществляется с помощью обычного светового микроскопа, в котором заменяют объективы и конденсор на специальные - фазово-контрастные.

Люминесцентная микроскопия. Люминесценция - это свечение объекта за счет поглощенной световой энергии коротковолновой или ультрафиолетовой части спектра. Большинство микроорганизмов не обладает собственной люминесценцией, поэтому пользуются наведен­ной люминесценцией путем обработки микробов флюорохромами. Чаще всего используют акридин-оранж, аурамин, изоцианат флюоресцеина, которые светятся под влиянием ультрафиолетовых лучей. Некоторые флюорохромы избирательно связываются с определенными структура­ми, такими, как ядро, цитоплазма, включения. Таким образом можно дифференцировать эти структуры.

Препараты, обработанные флюорохромами, микроскопируют в специальных люминесцентных микроскопах, в которых объекты иссле­дуются в ультрафиолетовых лучах.

Люминесцентная микроскопия используется для реакции имму­нофлюоресценции (РИФ). В этой реакции для определения вида мик­робов препарат-мазок из исследуемого материала обрабатывают спе­цифической антисывороткой, соединенной с флюорохромом. Если в материале содержатся микробы, соответствующие антисыворотке, то при микроскопии препарата в люминесцентном микроскопе наблюдает­ся свечение микробов.

Электронная микроскопия. Возможности разрешающей способнос­ти светового микроскопа ограничены не качеством линз, а длиной волны видимого света. В электронном микроскопе вместо световых лучей используется поток электронов. Источником электронов явля-

ется раскаленная вольфрамовая нить. Роль линз в электронном мик­роскопе выполняет круговое магнитное поле, Вначале электроны по­падают в магнитный конденсор и сходятся в одной точке на расс­матриваемый предмет, лежащий в безвоздушной среде на тонкой пленке коллодия. Затем пучок электронов проходит через объектив­ную и проекционные линзы. Наблюдатель видит не поток электронов, а изображение, которое принимается на флуоресцирующий экран или фотографическую пленку. Возникновение изображения на экране обусловлено тем, что различные части исследуемого объекта обла­дают неодинаковой проницаемостью для электоронов. Электроноплот­ные участки выглядят темными, электронопрозрачные - светлыми.

С помощью электронного микроскопа можно наблюдать вирусы, детали морфологии микробов. Используя метод иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ), можно видеть и сфотографировать вирусы с при­соединившимися к ним антигенами.