Глава 4. Физиология микроорганизмов

Как все живые существа, микроорганизмы осуществляют процес­сы питания, дыхания, роста и размножения. В то же время для мик­роорганизмов характерны некоторые особенности, отличающие их от высших организмов. Будучи одноклеточными, микроорганизмы самос­тоятельно осуществляют все жизненные процессы, и регуляция этих процессов заложена в каждой клетке.

Химический состав микроорганизмов

Значительную часть клетки составляет вода - от 70 до 85% от общей массы. Вода служит средой, в которой протекают разнообраз­ные химические процессы микробной клетки. В ней растворяются кристаллоиды, диссоциируют электролиты, формируются коллоиды. Кроме того, сама вода как химический компонент, непосредственно участвует в реакциях гидролиза белков, углеводов и липоидов. Ко­личество воды в клетке постоянно, и это постоянство регулируется цитоплазматической мембраной.

Сухой остаток микробной клетки составляет от 15% до 30%. Из них половина приходится на белки. Это простые белки - протеины и сложные белки - протеиды. Аминокислотный состав белков характерен для различных видов микроорганизмов. Белки входят в состав ферментов. Белками являются экзотоксины, с которыми связана па­тогенность целого ряда микробов: белками являются многие антиге­ны, с ними связана специфичность микробов.

Нуклеиновые кислоты являются важнейшими компонентами микро­бов. В ДНК зашифрована вся наследственная информация клетки, а РНК участвует в процессах считывания информации, передачи ее на рибосомы и синтеза в них белка - соответственно: матричная РНК (мРНК), рибосомальная РНК (рРНК) и транспортная РНК (тРНК).

Установлено, что состав нуклеотидов ДНК, а именно соотноше­ния гуанин + цитозин / аденин + тимин является стабильным приз­наком. Поэтому его можно использовать для определения таксономи­ческого положения бактерий. Например, у стафилококков процентное содержание Г+Ц=28%-39%, а у сходных с ними микрококков Г+Ц=65%-83%, следовательно, они принадлежат к разным родам.

Липиды у бактерий, не содержащих жировые вещества в виде включений, составляют около 10% сухого остатка. У бактерий, име­ющих особые жировые включения, например, у микобактерий туберку­леза, количество липидов достигает 40%, что обеспечивает этим бактериям устойчивость к кислотам, щелочам, спиртам. В состав липидов входят нейтральные жиры, фосфолипиды и свободные жирные кислоты. Фосфолипиды являются составной частью цитоплазматичес­кой мембраны, принимают участие в транспорте веществ. Липиды входят в состав липополисахарида клеточной стенки грамотрица­тельных бактерий - это их эндотоксин и О-антиген.

Углеводы выполняют в клетке пластическую роль и являются источником энергии, необходимым для обменных процессов. Коли­чество углеводов в клетке непостоянно даже у одной и той же бак­терии (от 10% до 30%) и зависит не только от рода и вида, но и от условий развития микробов. Бактерии содержат моносахариды, дисахариды, полисахариды. У некоторых бактерий полисахаридный антиген настолько специфичен, что позволяет разграничить отдель­ные типы внутри вида. Например, капсульный антиген пневмококков, поверхностный С-антиген стрептококков.

Минеральные вещества микроорганизмов разнообразны, коли­чество и состав их зависит от вида микробов и состава питатель­ной среды. Основные элементы, необходимые для жизнедеятельности клетки - натрий, калий, фосфор, кальций, магний, железо, медь, сера, хлор, кремний. Некоторые металлы - железо, кальций - входят в состав ферментов. Фосфор входит в состав аденозинтрифос­форной кислоты, которая является своеобразным аккумулятором энергии. Ионы металлов участвуют в поддержании постоянства осмо­тического давления, реакции среды (pH) в клетке. Реакция цитоп­лазмы слабощелочная. Заряд на поверхности бактерий - отрицатель­ный, у спирохет - положительный. Благодаря одноименному заряду, бактерии в физрастворе образуют равномерно-мутную взвесь. Склеи­вание их между собой и образование хлопьев наблюдается при реак­ции агглютинации, а также при потере поверхностного заряда клет­ки, например, у шероховатых R-форм бактерий.

Метаболизм (обмен веществ) микроорганизмов.

Питание микробов (конструктивный метаболизм).

Как у всего живого, метаболизм микроорганизмов состоит из двух взаимосвязанных, одновременно протекающих, но противополож­ных процессов - анаболизма, или конструктивного метаболизма, и катаболизма, или энергетического метаболизма.

Обмен веществ у микроорганизмов имеет свои особенности.

1)Быстрота и интенсивность обменых процессов. За сутки мик­робная клетка может переработать такое количество питательных веществ, которое превышает ее собственный вес в 30-40 раз.

2)Выраженная приспособляемость к изменяющимся условиям внешней среды.

3)Питание совершается через всю поверхность клетки. Прока­риоты не проглатывают питательные вещества, не переваривают их внутри клетки, а расщепляют их вне клетки с помощью экзофермен­тов до более простых соединений, которые транспортируются в клетку.

Для роста и жизнедеятельности микроорганизмов им необходимо наличие в среде обитания питательных материалов для построения компонентов клетки и источники энергии. Для микробов необходима вода, источники углерода, кислорода, азота, водорода, фосфора, калия, натрия и других элементов. Требуются также микроэлементы: железо, марганец, цинк, медь для синтеза ферментов. Различные виды микробов нуждаются в тех иных факторах роста, таких, как витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания.

В зависимости от способности усваивать органические или не­органические источники углерода и азота микроорганизмы делятся

на две группы - аутотрофов и гетеротрофов.

Аутотрофы (греч. autos - сам, trophic - питающийся) получа­ют углерод из углекислоты (CO₂) или ее солей. Из простых неорга­нических соединений они синтезируют белки, жиры, углеводы, фер­менты.

Гетеротрофы (греч. heteros - другой, trophic - питающийся) используют сложные органические соединения, такие как углеводы, спирты, аминокислоты, органические кислоты. Среди гетеротрофных микроорганизмов различают сапрофитов (греч. sapros - гнилой, phyton - растение) и паразитов. Сапрофиты используют мертвые ор­ганические соединения. Они широко распространены в природе, раз­лагают органические вещества, отбросы, участвуя таким образом в санитарной очистке окружающей среды. Паразиты живут и размножа­ются в тканях человека. животных, растений.

Микробы могут изменять свой тип питания с паразитического на сапрофитный. Их можно культивировать вне организма, на пита­тельных средах. Среди прокариотов исключение составляют риккет­сии и хламидии, которые могут жить только в живых клетках хозяи­на. Их называют строгими, или облигатными паразитами (лат. obli­gatus - обязательный). Облигатными паразитами являются также все вирусы.

Транспорт питательных веществ.

Через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану внутрь клетки прокариотов проникают только небольшие молекулы, поэтому белки, полисахариды и другие биополимеры вначале расщепляются экзоферементами до более простых соединений, которые транспорти­руются внутрь клетки.

Проникновение питательных веществ в клетку происходит с по­мощью различных механизмов.

Пассивная диффузия - вещества поступают в клетку вследствие диффузии по градиенту концентрации, то есть вследствие того, что концентрация вне клетки выше, чем внутри.

Облегченная диффузия - также совершается по градиенту кон­центрации, но с участием ферментов-переносчиков, так называемых пермеаз. Этот фермент присоединяет к себе молекулы вещества на внешней стороне цитоплазматической мембраны и отдает его на внутренней стороне в неизмененном виде. Затем свободный перенос-

чик перемещается снова к наружной стороне мембраны, где связыва­ет новые молекулы вещества. При этом каждая пермеаза переносит какое-то определенное вещество.Эти два механизма переноса не требуют энергетических затрат. Активный перенос происходит также с участием пермеаз,причем осуществляется против градиента концентрации. Микробная клетка может накопить вещество в концентрации, в тысячи раз превышающих ее во внешней среде. Такой процесс требует затрат энергии, то есть расходуется АТФ.

Транслокация радикалов - это четвертый механизм передачи веществ. Это активный перенос химически измененных молекул, с участием пермеаз. Например, такое простое вещество, как глюкоза, переносится в фосфорилированном виде.

Выход веществ из бактериальной клетки происходит путем пас­сивной диффузии или путем облегченной диффузии с участием перме­аз.

Ферменты

Ферменты - катализаторы биологических процессов. Характер­ным свойством ферментов является их специфичность. Каждый фер­мент участвует только в определенной реакции с определенным хи­мическим соединением.

Ферменты, которые выделяются бактериальной клеткой в окру­жающую среду и осуществляют внеклеточное переваривание, называ­ются экзоферментами. К экзоферментам относится также бета-лакта­маза, которая разрушает пенициллин и другие бета-лактамные анти­биотики, защищая бактерии от их действия.

Эндоферменты участвуют в процессах метаболизма внутри клет­ки.

Многие патогенные бактерии, кроме ферментов обмена, выделя­ют ферменты, являющиеся факторами вирулентности. Например, такие ферменты, как гиалуронидаза, коллагеназа, дезоксирибонуклеаза, нейраминидаза способствуют продвижению и распространению пато­генного микроба в организме.

Способность бактерий продуцировать определенные ферменты - признак настолько постоянный, что его используют для идентифика­ции, то есть определения вида бактерий. Определяют сахаролити­ческие свойства (ферментацию углеводов) и протеолитические

свойства (ферментацию белков и пептона).

Для микробов характерна высокая ферментативная активность. Это используется в промышленности. В медицине находят применение такие лечебные средства, как стрептокиназа (фибринолизин стреп­тококков), террилитин (протеаза Aspergillus terricola). Ферменты микробного происхождения - липазы и протеазы, входящие в состав моющих средств и стиральных порошков, расщепляют белковые и жи­ровые загрязнения до воднорастворимых веществ, которые легко смываются водой.

Биологическое окисление (энергетический метаболизм).

Процесс биологического окисления дает энергию, необходимую для жизни клетки. Сущность процесса заключается в последователь­ном окислении субстратов с постепенным освобождением энергии. Энергия запасается в молекулах АТФ.

Окислению подвергаются углеводы, спирты, органические кис­лоты, жиры и другие вещества. Но для большинства микроорганизмов источником энергии служат гексозы, в частности, глюкоза.

У микроорганизмов существует два типа биологического окис­ления: аэробный и анаэробный.

При аэробном типе дыхания участвует кислород, и этот про­цесс называется дыханием в строгом смысле слова.

При анаэробном типе биологического окисления освобождение энергии из органических молекул происходит без участия кислорода и называется брожением.

Начальный этап анаэробного расщепления глюкозы с образова­нием пировиноградной кислоты (ПВК) происходит одинаково. Эта кислота является тем центральным пунктом, от которого расходятся пути дыхания и многих видов брожений.

При аэробном типе дыхания пировиноградная кислота вступает в цикл трикарбоновых кислот. Водород ПВК поступает в дыхательную цепь. Это цепь окислительных ферментов (цитохромы и цитохромок­сидаза). По цепи цитохромов передается водород и присоединяется к активированному под действием цитохромоксидазы кислороду с об­разованием воды. Конечные продукты аэробного окисления глюкозы - диоксид углерода (углекислота) и вода. В процессе дыхания на од­ну молекулу глюкозы образуется 38 молекул АТФ.При анаэробном типе биологического окисления энергия образуется в результате брожений. При спиртовом брожении ПВК превра­щается в конечном итоге в спирт и углекислоту. Конечным продук­том молочнокислого брожения является молочная кислота, масляно­кислого брожения - масляная кислота. При процессах брожения на одну молекулу глюкозы образуется только 2 молекулы АТФ.

Микробную природу брожений впервые открыл и доказал Пастер. Изучая маслянокислое брожение, Пастер впервые столкнулся с воз­можностью жизни без кислорода, то есть с анаэробиозом. Он также установил явление, которое впоследствии было названо "эффектом Пастера": прекращение процесса брожения при широком доступе кис­лорода.

Анаэробиоз существует только среди прокариотов. Все микро­организмы по типу дыхания делятся на следующие группы: аэробы, анаэробы, факультативные анаэробы, микроаэрофилы.

Облигатные аэробы размножаются только при наличии свободно­го кислорода. К ним можно отнести микобактерии туберкулеза, хо­лерный вибрион, чудесную палочку.

Облигатные или строгие анаэробы получают энергию при от­сутствии доступа кислорода. Они имеют неполный набор окислитель­но-восстановительных ферментов, у них нет цитохромной системы, поэтому у них не происходит полного окисления субстрата (глюко­зы) до конечных продуктов - СО₂ и Н₂О. Более того, в присутствии свободного кислорода образуются токсические соединения: перекись водорода Н₂О₂ и свободный перекисный радикал кислорода О₂^-. Аэ­робы при этом не погибают, так как продуцируют ферменты, разру­шающие эти токсические соединения (супероксиддисмутазу и катала­зу). Спорообразующие анаэробы в этих условиях прекращают размно­жение и превращаются в споры. Неспорообразующие анаэробы погиба­ют даже при кратковременном контакте с кислородом.

К облигатным спорообразующим анаэробам относятся клостридии столбняка, ботулизма, анаэробной раневой инфекции; к неспорооб­разующим анаэробам - бактероиды, пептобактерии, бифидумбактерии.

Большинство патогенных бактерий - факультативные (условные) анаэробы, например, энтеробактерии. Они имеют полный набор фер­ментов и при широком доступе кислорода окисляют глюкозу до ко­нечных продуктов; при низком содержании кислорода они вызывают брожение.

Микроаэрофилы размножаются в присутствии небольших коли­честв кислорода. Например, кампилобактеры могут размножаться при

3-6% кислорода.

Рост и размножение микроорганизмов.

Термином "рост" обозначают увеличение размеров отдельной особи, а "размножение" - увеличение числа особей в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. У грамположительных бактерий из клеточной стенки и цитоплазматической мембраны образуется перегородка, врастающая внутрь. У грамотрицательных бактерий образуется пере­тяжка, и затем происходит разделение клетки на две особи.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромо­сомы по полуконсервативному типу. При этом двуспиральная цепь ДНК рскручивается, каждая нить достраивается комплементарной нитью, в результате каждая дочерняя клетка получает одну мате­ринскую нить и одну вновь образованную.

Быстрота размножения разных видов бактерий различна. Боль­шинство бактерий делятся каждые 15-30 минут. Микобактерии тубер­кулеза делятся медленно - один раз за 18 часов, спирохеты - один раз за 10 часов.

Если посеять бактерии в жидкую питательную среду определен­ного объема и затем каждый час брать пробу и определять коли­чество живых бактерий в такой замкнутой среде и составить гра­фик, на котором по оси абсцисс откладывать время в часах, а по оси ординат логарифм количества живых бактерий, то получим кри­вую роста бактерий. Рост бактерий подразделяют на несколько фаз (Рис. 5):

1)латентная фаза (лаг-фаза) - бактерии адаптируются к пита­тельной среде, количество их не увеличивается;

2)фаза логарифмического роста - количество бактерий увели­чивается в геометрической прогрессии;

3)фаза стационарного роста, во время которой число вновь образованных бактерий уравнивается числом погибших, и количество живых бактерий остается постоянным, достигая максимального уров­ня. Это М-концентрация - величина, характерная для каждого вида бактерий;

4)фаза отмирания, когда число отмирающих клеток начинает преобладать над числом жизнеспособных бактерий вследствие накоп­ления продуктов метаболизма и истощения среды.

Культура бактерий в такой замкнутой несменяющейся среде на­зывается периодической. Если же в засеянный объем непрерывно по­дают свежую питательную среду и удаляют такое же количество жид­кости, то такую культуру называют непрерывной. Количество живых бактерий в такой культуре будет постоянно в М-концентрации. Неп­рерывное культивирование применяют в микробиологической промыш­ленности.

Образование микробами пигментов, ароматических веществ.

Светящиеся микроорганизмы.

Некоторые виды микробов вырабатывают красящие вещества - пигменты. Если пигмент растворим в воде, то окрашенными предс­тавляются и колонии микробов, и питательная среда. Например, си­ний пигмент, выделяемый синегнойной палочкой (Pseudomonas aЙru­ginosa), окрашивает среду в синий цвет. Пигменты, растворимые в органических растворителях, но нерастворимые в воде, не окраши­вают питательную среду. Такой пигмент красного цвета, так назы­ваемый продигиозан, растворимый в спирте, выделяет чудесная па­лочка (Serratia marcescens). К этой же группе относятся пигменты желтого, оранжевого, красного цвета, характерные для кокковой воздушной микрофлоры. У некоторых видов микробов пигменты нас­только прочно связаны с протоплазмой клетки, что не растворяются ни в воде, ни в органических растворителях. Среди патогенных бактерий такие пигменты золотистого, палевого, лимонно-желтого цвета образуют стафилококки.

Цвет пигмента используется для определения вида бактерий.

Некоторые микроорганизмы в процессе метаболизма вырабатыва­ют ароматические вещества. Например, для синегнойной палочки ха­рактерен запах жасмина. Характерный запах сыров, сливочного мас­ла, особый "букет" вина объясняется жизнедеятельностью микробов, которые используются для производства этих продуктов.

Свечение (люминесценция) микробов происходит в результате освобождения энергии при биологическом окислении субстрата. Све­чение бывает тем интенсивнее, чем сильнее приток кислорода. Све­тящиеся бактерии были названы фотобактериями. Они придают свече­ние чешуе рыб в море, грибам, гниющим деревьям, пищевым продук­там, на поверхности которых размножаются. Свечение может наблю­даться при низких температурах, например, в холодильнике. Патогенных для человека среди фотогенных бактерий не установлено.

Свечение пищевых продуктов, вызванное бактериями, не приводит к их порче, и даже может свидетельствовать о том, что в этих про­дуктах не происходит гниения, поскольку прекращается при разви­тии гнилостных микроорганизмов.