Механизмы действия ферментов.

Первоначальным событием при действии фермента является его специфическое связывание с лигандом - субстратом (S). Это происходит в области активного центра, который формируется из нескольких специфических R-групп аминокислот, определенным образом ориентированных в пространстве.

У некоторых ферментов в активном центре располагается и кофактор. Одни R-группы активного центра принимают участие в связывании субстрата, другие - в катализе. Некоторые группы могут делать и то, и другое. Детальный механизм действия каждого фермента уникален, но есть общие черты в «работе» ферментов, которые заключаются в следующем: высокая избирательность действия фермента обеспечивается тем, что субстрат связывается в активном центре фермента в нескольких точках и это исключает ошибки; активный центр располагается в углублении (нише) поверхности фермента и имеет комплементарную субстрату конфигурацию. В результате субстрат окружается функциональными группами активного центра фермента и изолируется от водной среды. Связывание субстрата с ферментом часто вызывает конформационные изменения, что ведет к правильному (оптимальному) расположению аминокислотных остатков, требуемому для протекания катализа, и тем самым увеличивает специфичность фермент-субстратного взаимодействия (индуцированное соответствие). Так как максимальная активность фермента обусловлена оптимальной конформацией молекулы фермента в целом и активного центра в частности, то даже небольшие изменения окружающих условий, которые затрагивают связывание субстрата или конформацию третичной структуры белка, будут влиять на скорость ферментативной реакции. Например, изменение рН приводит к изменению степени ионизации ионогенных групп фермента и, следовательно, ведет к перераспределению межрадикальных связей в третичной структуре. Оптимальное рН для каждого фермента означает некоторое оптимальное состояние его ионизации, соответствующее наилучшей комплементарности. Изменение температуры вызывает противоречивый эффект: с одной стороны, при повышении температуры до 37 - 40^о скорость ферментативной реакции увеличивается, что закономерно для катализа; с другой стороны, при температуре более 50^о начинается денатурация фермента.

А. Типы ингибирования

Большинство ингибиторов ферментов действуют обратимо, т. е. не вносят в молекулу фермента каких-либо изменений после своей диссоциации. Однако существуют также необратимые ингибиторы ферментов, которые необратимо модифицируют целевой фермент. Принцип действия ингибитора, тип его ингибирования определяют путем сравнения кинетики реакции в присутствии ингибиторам без него (см. схему Б). Различают конкурентное (А, слева) и неконкурентное (А, справа) ингибирование. В регуляции обмена веществ важную роль играет аллостерическое ингибирование (А, 6).

Так называемые аналоги субстрата (2) имеют свойства, подобные свойствам субстрата целевого фермента. Они обратимо блокируют часть молекул имеющегося в наличии фермента, но не могут далее превращаться в продукт. Поэтому для достижения половины максимальной скорости реакции необходимы более высокие концентрации субстрата: в присутствии такого ингибитора константа Михаэлиса K_m растет (Б). Субстрат в высоких концентрациях вытесняет ингибитор с фермента. Поэтому максимальная скорость V при этом типе торможения не претерпевает изменений. Так как субстрат и ингибитор конкурируют за место связывания на ферменте, данный тип торможения называют конкурентным. Аналоги переходного состояния (3) также действуют как конкурентные ингибиторы.

Если ингибитор реагирует с функционально важной группой фермента, не препятствуя связыванию субстрата, такое ингибирование называется неконкурентным (на схеме справа). В этом случае K_m остается неизменной, напротив уменьшается концентрация функционально активного фермента [Е] _t и, следовательно, максимальная скорость реакции V. Неконкурентные ингибиторы действуют как правило необратимо, поскольку они модифицируют функциональные группы целевого фермента (4).

В случае так называемых "суицидных субстратов" (5) речь идет о субстратных аналогах, содержащих дополнительно реакционную группу. Вначале они связываются обратимо, а затем образуют ковалентное соединение с активным центром фермента. Поэтому ингибирование такими соединениями проявляется как неконкурентное. Известным примером такого ингибитора является антибиотик пенициллин.

Аллостерические ингибиторы связываются с отдельными участками фермента вне активного центра (6). Такое связывание влечет за собой конформационные изменения в молекуле фермента, которые приводят к уменьшению его активности . Аллостерические эффекты встречаются практически только в случае олигомерных ферментов. Кинетику таких систем нельзя описать с помощью простой модели Михаэлиса-Ментен.

Терапевтическое действие аспирина как жаропонижающего и противовоспалительного средства объясняется тем, что аспирин ингибирует один из ферментов, катализирующий синтез простагландинов (ПГ). Простагландины - вещества, участвующие в развитии воспаления. Ингибирование обусловлено ковалентной модификацией одной из аминогрупп фермента - простагландинсинтетазы.

Обратимые ингибиторы. Существует два типа подобных ингибиторов - конкурентные и неконкурентные. Конкурентный ингибитор конкурирует с субстратом за связывание с активным центром. Это происходит потому, что ингибитор и субстрат имеют сходные структуры. В отличие от субстрата связанный с ферментом конкурентный ингибитор не подвергается ферментативному превращению.

Неконкурентное обратимое ингибирование не может быть ослаблено или устранено повышением концентрации субстрата, так как эти ингибиторы присоединяются к ферменту не в активном центре, а в другом месте.

Связывание приводит к изменению конформации фермента и нарушению комплементарности к субстрату. Неконкурентные ингибиторы могут обратимо связываться как со свободным ферментом, так и с комплексом ES. Наиболее важными неконкурентными ингибиторами являются образующиеся в живой клетке промежуточные продукты метаболизма, способные обратимо связываться с определенными участками ферментов (аллостерические центры) и изменять их активность, что является одним из способов регуляции метаболизма. Исследование действия ингибиторов используется при изучении механизма действия фермента, кроме того, помогает в поисках более эффективных лекарственных средств, так как лечебное действие многих лекарств обусловлено тем, что они являются ингибиторами определенных ферментов. Структурные аналоги коферментов тоже могут быть ингибиторами. Кинетические тесты позволяют отличить конкурентное ингибирование от неконкурентного.

Ингибирование избытком субстрата наблюдается в ряде случаев в результате блокирования активного центра по схеме: