4Люминесцентный микроскоп
Принцип работы этого микроскопа основан на явлении люминесценции. Для получения изображения объектов их обрабатывают флюорохромами, которые при возбуждающем облучении коротковолновой частью спектра светятся цветами с большей длиной волны (зеленым, оранжевым и др.). В люминесцентном микроскопе изучают как живые, так и убитые микробы (с "сухой" или иммерсионной системами). Люминесцентная микроскопия позволяет получить контрастное цветное изображение, обнаружить малое количество микробов, изучить их структуру и химический состав, использовать метод иммунофлюоресценции.
5Электронный микроскоп
Этот прибор отличается от световых микроскопов значительно большей разрешающей способностью (около 0,001 мкм) за счет использования вместо света пучка электронов, а вместо стеклянных оптических - электромагнитных линз. В электронном микроскопе изучают вирусы, ультраструктуру убитыхх микроорганизмов. Приготовление препарата для микроскопического
исследования.
Окраска по Граму.
I - приготовление мазка.
Предметное стекло обжигают в пламени газовой горелки.Восковым карандашом отмечают пределы будущего мазка в видеокружности диаметром 1-2 см. и кладут стекло на стол.Прокаленной петлёй наносят в середину кружка небольшуюкаплю стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Затем в эту каплю вносят небольшое количествокультуры бактерий, тщательно эмульгируют и распределяюттонким слоем в пределах кружка. Мазки из бульонных культурготовят без предварительного нанесения ИХН.
2 - высушивание.
Стекло оставляют на воздухе до исчезновения влаги.
3 - фиксация.
Фиксацию проводят для того, чтобы убить микробы, прикрепитьих к стеклу, повысить их восприимчивость к красителям. Дляфиксации предметное стекло (мазком вверх) триждынакладывают на пламя горелки на 2-3 секунды с интервалом 4-6секунд. Мазки из гноя, крови, мокроты, отечной жидкостификсируют погружением в фиксирующие жидкости (ацетон,
смесь Никифорова). Такая фиксация позволяет избежать грубыхдеформаций объекта исследования.
4 - окраска.
Различают простые и сложные (дифференцирующие) способыокраски. Простые способы позволяют судить о величине, форме,локализации и взаимном расположении клеток. Сложныеспособы позволяют установить структуру микробов и часто ихнеодинаковое отношение к красителям. Примером простых способов может служить окраска фуксином (1-2 минуты), метиленовым синим или кристалл-виолетом (3-5 минут), а сложных • окраска по Граму, Романовскому-Гимзе, Циль-Нильсену.
Дифференцирующий метод Грама.
После окраски этим методом одни бактерии, окрашиваются в темно-фиолетовый цвет (грамположительные, Гр+), другие - в бордово-красный (грамотрицательные, Гр-). Сущность этого способа окраски состоит в том, что Гр+ бактерии прочно фиксируют комплекс из генцианвиолета и йода, не обесцвечиваясь этанолом. Гр- бактерии после обесцвечивания докрашивают фуксином.
Гр+ бактерии кокки
стафилококки, стрептококки;
палочки (спорообразующие): бациллы, клостридии; палочки (неспорообразующие): коринебактерии, микобактерии, актиномицеты
Гр- бактерии кокки
нейссерии, вейллонеллы; палочки (неспорообразующие): энтеробактерии, вибрионы; извитые: спириллы, спирохеты кампилобактерии.
После высушивания мазки готовы для микроскопии.
Основные формы бактерий
|
Шаровидные |
Палочковидные |
Извитые |
|
микрококки (одиночные) |
собственно бактерии |
спириллы |
|
диплококки (пары) |
спорообраэующие |
спирохеты |
|
стрептококки (цепочки) |
(бациллы, клостридии) |
кампилобактеры |
|
тетракокки (4 клетки) |
изогнутые палочки |
|
|
сарцины (тюки, пакеты) |
(вибрионы) |
|
|
стафилококки (гроздья) |
|
|
Структура бактериальной клетки. Обязательные (постоянные) структурные элементы
Обязательными структурными элементами бактерий являются: цитоплазма с нуклеоидом и рибосомами, цитоплазматическая мембрана (ЦПМ), клеточная стенка.
Цитоплазма прокариотовв отличие от эукариотов не содержит митохондрий и хлоропластов, аппарата Гольджи, лизосом, эндоплазматической сети. Нуклеоид выполняет в клетке бактерий функцию ядра, т.е. является носителем генетической информации, однако, в отличие от ядра эукариотическоЙ клетки, он не имеет ядерной мембраны, не делится митозом. Нуклеоид состоит из замкнутой в кольцо нити ДНК. В генетическом отношении ДНК нуклеоида является единственной бактериальной хромосомой. В связи с этим бактерии имеют гаплоидный набор генов, контролирующих все их жизненно важные функции. Органеллы цитоплазмы выявляются при электронной микроскопии.
Цитоплазматическая мембранаограничивает снаружи цитоплазму и состоит яз тонкого слоя фосфолипидов и белка. Функции ЦПМ: получение энергии в результате биологического окисления, участие в питании посредством активного транспорта веществ, участие в биосинтезе веществ, делении клетки. В состав ЦПМ входят окислительные ферменты, пермеазы, различные биосинтетические ферменты. ЦПМ выявляют при электронной микроскопии.
Клеточная стенкау Гр+ бактерии, как правило, содержит многослойный пептидогликан, который придает клеточной стенке прочность.
Клеточная стенка определяет форму бактерий, служит для механической защиты, участвует в питании за счет диффузии и осмоса. У Гр- бактерий клеточная стенка представлена тонким слоем пептидогликана, покрытого наружной мембраной, в состав которой входят белки, фосфолипиды и липополисахариды (ЛПС). Наружная мембрана клеточной стенки патогенных микробов во многом определяет специфичность их взаимодействия с организмом хозяина и помогает в распознавании близкородственных микробов. По компонентам и структуре клеточной стенки, биохимическим механизмам ее синтеза бактерии коренным образом отличаются от животных и растений. Поэтому лекарственные препараты, специфически воздействующие, например, на бактериальные стенки, безвредны для высших организмов. Клеточную стенку бактерий выявляют при электронной микроскопии, специальным окрашиванием или в опыте плазмолиза.
Необязательные (непостоянные) структурные элементы.К ним относят: капсулу, спору, включения, жгутики, пили.Капсула представляет собой поверхностно расположенноеслизистое образование, которое по химической природе чащеявляется полисахаридом. Капсула выполняет защитнуюфункцию, предохраняя клетку во внешней среде от высыхания идругих неблагоприятных факторов, а в организме хозяина – отфагоцитоза, бактериолизиса и других реакций, лекарственныхпрепаратов. Бактерии, образующие капсулу в организме и напитательных средах, называют капсульными (например, клебсиеллы пневмонии). Некоторые бактерии образуют макрокапсулу только в организме (золотистый стафилококк, стрептококк пневмонии, палочка сибирской язвы, возбудитель чумы, туляремии и др.). Многие бактерии образуют
микрокапсулу: возбудитель коклюша, патогенные энтеробактерии и др. Капсулу выявляют методом Бурри-Гинса: бактерии смешивают с каплей туши, распределяют их по стеклу виде тонкого мазка и фиксируют. После окрашивания разведенным карболовым фуксином в световом микроскопе на серо-коричневом (тушевом) фоне препарата видны красные тела бактерий, окруженные бесцветными зонами капсул. Споры являются формой существования, предназначенной для сохранения бактерий во внешней среде. В одной бактериальной клетке в течение 12-18 часов формируется 1 спора, которая при благоприятных условиях за 4-6 часов прорастает в 1 вегетативную клетку. Спорообразующими являются, как правило, Гр+ палочковидные бактерии: те, у которых диаметр споры не превышает поперечный размер клетки, называют бациллами, те, у которых диаметр больше - клостридиями. Устойчивость спор к неблагоприятным физико-химическим воздействиям связана с наличием многослойной оболочки, повышенным содержанием липидов, ионов кальция, магния, вода в связанном состоянии. Жизнеспособность спор при обычных условиях может сохраняться в течение десятилетий и столетий. Для уничтожения спор применяют методы стерилизации (пар под давлением, горячий воздух и др.). Споры окрашиваются плохо. Для выявления используют сложные методы окраски {по Циль-Нильсену)
Включения. В клетках прокариотов можно обнаружить включения (скопления полисахаридов, липидов, полифосфатов, серы). У дифтерийной палочки и некоторых других бактерий в цитоплазме обнаруживаются збрна волютина (полифосфаты), выполняющие функцию запасного вещества (источника фосфора и энергии). Включения и цитоплазма по-разному окрашиваются одними и теми же красителями. Например, при окраске уксуснокислым генциан-виолетом цитоплазма у дифтерийной палочки окрашивается в бледно-фиолетовый цвет, а расположенные по полюсам зерна волютина - в темно-фиолетовый. Обнаружение зёрен волютина имеет диагностическое значение. Жгутики - являются поверхностными придатками бактериальной клетки, состоят га белка флагеллина и выполняет функцию движения. Наиболее подвижки микробы с 1 жгутиком -монотрихи (холерный вибрион) менее подвижны микробы с пучком жгутиков на одном из полюсов - лофотрихи (синегнойная палочка) или имеющие жгутики на обоих полюсах - амфитрихи; наименее подвижны перитрихи, у которых жгутики расположены по бокам или по, всей поверхности (многие энтеробактерии). В световом микроскопе жгутики не видны. Для их выявления используют прямые методы: электронную микроскопию или специальное окрашивание, позволяющие увеличить размеры жгутиков, например, за счет наслоения солей тяжелых металлов. С целью косвенного выявления жгутиков изучают подвижность микробных клеток. Для этого готовят нативные препараты (раздавленная или висячая капля), которые микроскопируют в затемненном поле зрения, темнопольном или фазовоконтрастном микроскопах.
Пили - также являются поверхностными придатками бактериальной клетки и представляют собой тончайшие нити (тоньше и короче жгутиков), состоят из белка пилина. Функцией пилей являются прикрепление к субстрату; они также способствуют контакту клетки - донора с клеткой - реципиентом при конъюгации. Наличие пилей у патогенных микробов во многом определяет их способность вызывать заболевание, т.к. они необходимы для осуществления адгезии (прилипания). Прямое выявление пилей возможно только при электронной микроскопии.
Химический состав бактериальной клетки.
Основными веществами, входящими в ее состав, являются: вода (свободная и связанная), нуклеиновые кислоты ДНК и РНК), белки, углеводы, липиды и минеральные соли. Свободная вода, являясь универсальной дисперсионной средой, участвует в метаболизме, связанная вода - определяет устойчивость клетки к физическим факторам. Нуклеиновые кислоты являются носителями наследственной информации. Белки входят в состав различных структур бактериальной клетки, являются составной частью ферментов, токсинов, антигенов, определяют отношение к красителям, лекарственным и дезинфицирующим веществам. Углеводы являются источником энергии, и, наряду с белками, могут определять специфичность бактерий. Липиды определяют заряд клетки и проницаемость мембран, устойчивость к кислотам, щелочам, спиртам, а также токсичность микроба.
ДЕЙСТВИЕ НА МИКРОБЫ ФИЗИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ.
Действие физических факторов. I
Высушиваниегубительно действует на микробы, однако разные виды обладают различной чувствительностью к высушиваниию. | Холерный вибрион гибнет через 48 часов, возбудитель
туберкулёза - через 70 дней. Длительно сохраняются микробы в высохших плёнках из гноя, крови или мокроты (месяцы), высушивание практически не действует на споры. В процессе высушивания клетка лишается воды, происходит инактивация ферментных систем, наступает гибель микроба. Высушивание применяют в медицине: в сухом виде хранят лекарственное сырьё, многие лекарства. Широко применяется лиофильная
сушка - высушивание из замороженного состояния в вакууме. В этом случае вода переходит из кристаллического состояния в парообразное, минуя жидкую фазу, жизнеспособность микробов охраняется; срок годности живых вакцин и других иммунобиологических препаратов увеличивается до 1 года и более.
Лучистая энергия(ультрафиолет и ионизирующее излучение) непосредственно действует за нуклеиновые кислоты в клетке, вызывая смертельные мутации, или приводит к образованию свободах радикалов, вызывающих инактивацию ферментных систем. Солнечный свет, особенно его коротковолновая часть
спектра, оказывает выраженный бактерицидный эффект. УФЛ используют в медицине для обработки операционных, родильных домов и отделений, асептических помещений аптек, в бактериологических лабораториях. Для этих целей устанавливают бактерицидные облучатели с длиной волны 260-300 нм Ионизирующее излучение используют для стерилизации.
Ультразвук вызывает гибель микроорганизмов: в клетке образуются кавитационные полости с резкими перепадами разреженного и избыточного давления, что приводит к разрушению клетки. Этот метод используют для получения компонентов микробной клетки, обеззараживания некоторых жидких препаратов, питьевой воды, молока, соков.
Температура ниже 0° С не оказывает губительного действия, однако микробы прекращают рост и размножение. Некоторые вирусы сохраняются при - 27С°. В медицине лекарственное сырье, многие лекарственные и биологические препараты хранят при температуре от 0°С до + 10°С (температура бытового холодильника) Высокие температуры более губительны для микробов, однако разные виды могут обладать неодинаковой чувствительностью. Так, менингококки гибнут уже при комнатной температуре, возбудитель сифилиса - при +40°С, возбудитель дизентерии - при +60°С, бруцеллы - при 100°С. Споры бактерий погибают лишь через 2-5 часов кипячения.
Стерилизация- полное обеспложивание объектов, при котором уничтожаются все формы микроорганизмов (вегетативные и споры). Для стерилизации применяют физические и химические методы. Выбор метода определяется видом стерилизующего материала, который после стерилизации должен сохранять свои основные свойства (форму, эластичность, активность и др.). Физические методы - действие высокой температуры, ионизирующего излучения.
Методы тепловой стерилизации: