1)Однократные методы:
-прокаливание горелка
-горячим воздухом сухожаровой шкаф 180 иС, 60 минут, (160 °С, 150 минут)
-паром под давлением (автоклав) 120 "С, 45 минут, давление 1 атм,(132 °С, 20 минут, давление 2 атм)
многократные методы:
-текучим паром автоклав с открытым клапаном 100 "С, 3 дня по 1 разу каждый день
-тиндализация дробная стерелизация
2)Многократные методы- это дробная стерилизация объектов, которые могут быть питательным субстратом для микробов (в промежутках между стерилизацией объект оставляли при комнатной температуре для прорастания спор). Образовавшиеся негетативные формы микроорганизмов уничтожаются.
Контроль процесса стерилизации осуществляют несколькими методами:
1) по показаниям приборов (манометров, термометров, таймеров);
2) с использованием физико-химических тестов (вместе со стерилизуемым материалом в аппарат закладывают ампулы с кристаллами веществ или специальные бумажные термохимические индикаторы; при нужной температуре вещества расплавляются, а индикаторы меняют цвет);
3) биологические тесты (в аппарат помещают пробирки с салфетками, пропитанными взвесью термостойкого спорообразующего микроба, и после стерилизации их инкубируют в ПБ, который не должен мутнеть).
Ионизирующее излучение это наиболее перспективный метод, г. к. возможна полная автоматизация всех процессов. Стерилизацию проводят в товарной упаковке, что обеспечивает длительность сохранения материала стерильным. Установка представляет собой бетонную камеру толщиной 2 метра, с надежной защитой от радионуклидов. После обработки материал контролируется на остаточную радиоактивность. Этим способом стерилизуют хирургический инструментарий, изделия пластмассы, вакцины, лечебные сыворотки, многие лекарства.
Методы химической стерилизации:
1) 6% раствор перекиси водорода экспозиция - 6 часов. Стерилизуют хирургический инструментарий, изделия полимерных материалов, резины, стекла;
2) «Дезоксон-1» 1%, 45 минут.
Газовая стерилизация. Используют смесь ОБ (смесь окиси этилена с бромистым метилом в соотношении 1: 2,5 (2000 мг/куб.дм, экспозиция 6-16 часов). Стерилизуют оптику, кардиостимуляторы, изделия из полимерных материалов радиоэлектронное оборудование. В некоторых случаях используют совместное воздействие физических и химических факторов.
Дезинфекция
Дезинфекция - комплекс мероприятий, направленных на уничтожение на объектах конкретных патогенных микробов. В медицине применяют физические и химические методы дезинфекции.
I Физические методы: 1) механические (вытряхивание,проветривание, влажная уборка, стирка с мылом); 2) действиевысокой температуры (прокаливание утюгом, кипячение,пастеризация); 3)УФО (облучение бактерицидными лампами).
II Химические методы - применяют в различных концентрацияхследующие дезинфицирующие вещества: I) хлорсодержащиепрепараты (хлорная известь, хлорамин Б, гипохлорит кальция,
хлоргексидия и др.); 2) окислители (перекись водорода,перманганат калия); 3) фенолы (карболовая кислота, лизол); 4)йод и Йодофоры (йод + поверхностно-активные вещества, ПАВ);
5) соли тяжёлых металлов (сулема, диоцид, мертиолсят); ПАВ(сульфанол); 7)_четвертичные аммонийные соединения, (роккал);8) 70% этанол; 9) формалин; 10) красители (бриллиантовыйзеленый); 11) кислоты (салициловая, борная и др.).
Механизм дезинфекции различен: механическое удаление;коагуляция белков при нагревании; хлорсодержащие препараты иформалин взаимодействуют с аминогруппами белков, окислители
- с сульфгидрильньши группами; фенолы повреждает клеточнуюстенку и нарушают процессы дыхания, соли тяжелых металловобразуют альбуминаты белков, ПАВ изменяют заряд клеточных мембран, четвертичные аммонийные соединения нарушают процессы дыхания, красители взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами и т.д.
Асептика - система профилактических мероприятий, направленных на предотвращение попадания в рану, микроорганизмов, лекарственные препараты. Она включает: I) стерилизацию инструментов, приборов, материалов; 2) специальную обработку рук; соблюдение определенных правил и приёмов работы (стерильный халат, маска, перчатки) Исключение разговоров и т.п.); 4) осуществление специальных мероприятии (правильная вентиляция, влажная уборка с применением дезинфицирующих средств, облучениебактерицидными лампами).
Антисептика - комплекс мероприятий, направленных на уничтожение микробов, попавших в рану. Применяют антисептику: I) механическую, например, удаление из раны инфицированных или нежизнеспособных тканей при обработке раны; 2) физическую (наложение гигроскопических повязок, применение гипертонических растворов, способствующих оттоку раневого, отделяемого в повязку, сухого тепла, УФС, лазера и т.д.
3) химическую (применяют химические вещества, обладающие бактерицидными или бактериостатическим действием при минимальном органотропном действии, например хлоргексидин; I лекарственные препараты вносят борную кислоту, мертиолят и
др.);
4) биологическую (применение антибиотиков, бактериофагов, иммуноглобулинов, средств, стимулирующих защитные силы Организма).
Пастеризация - однократное кратковременное прогревание при температуре ниже 80°С, частичное обеспложивание продуктов. Как и кипячение, пастеризация не является методом Стерилизации. После пастеризации сохраняются споры и вегетативные формы, поэтому пастеризованный продукт (молоко, соки и т.д.) хранят в холодильнике.
Контроля эффективности дезинфекции. Контроль текущей и заключительной дезинфекции в очагах кишечных инфекций основан на обнаружении в исследуемом материале кишечной палочки, постоянно находящейся в выделениях больных и по устойчивости близко стоящей к
возбудителям кишечных инфекций. После проведения дезинфекции в исследуемом материале кишечная палочка должна отсутствовать.
Для контроля работы дезинфекционных камер используют эталонные культуры, например, стафилококк - при обработке вещей из очагов инфекций, вызванных неспорообразующими микроорганизмами, споры антракоидной палочки - при дезинфекции вещей из очагов инфекций, вызванных спорообразующими микробами.
Основные положения работы централизованных стерилизационных отделений (ЦСО) в лечебно-профилактических учреждениях
Эти отделения созданы для предупреждения парентеральных заражений вирусными парентеральными гепатитами, ВИЧ-инфекцией, и другими заболеваниями, а также постинфекционных осложнений.
ЦСО осуществляет: I.) приём использованного и предварительно очищенного инструментария; 2) мойку инструментов с целью очистки от остатков лекарственных веществ и крови с последующей проверкой на наличие «скрытой» крови и остатков моющих средств (бензидиновая амидопириновая и фенолфталеиновая пробы); 3) упаковку инструментов, перчаток, перевязочного материала ведут в специальную бумагу, двойной слой мягкой упаковки, биксы; 4) стерилизацию, которая проводится в паровых стерилизаторах (температура 120°С, Р-1 атм., экспозиция 45 минут; температура 132°С, Р-2 атм., экспозиция 20 минут - так стерилизуют перчатки, инструментарий, перевязочный материал, белье), в воздушных стерилизаторах (температура 180°С, экспозиция 60 минут - так стерилизуют шприцы, металлические катетеры, шпатели, изделия из стекла и металла). Стерильный материал в биксах при упаковке в двойную бязевую ткань хранят не более 3 суток, в пергаменте - не более 3 недель.
ФИЗИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ,
ферменты микробов.
У микробной клетке ферменты катализируют многочисленные промессы биосинтеза клеточных структур и получения энергии. У бактерий обнаруживаются основные группы ферментов: гидролазы оксидоредукгазы, трансферазы, липазы, лигазы, изомеразы. Часть из них (экзоферменты) выделяется наружу, осуществляя внеклеточные реакции: расщепление макромолекул питательных веществ до простых соединений, разрушение антибиотиков (например, бета-лактамаза инактивирует
Пенициллин) и др. Эндоферменты катализируют реакции внутри клетки: расположенные в цитоплазматической мембране пермеазы переносят питательные вещества в клетку, оксидоредуктазы обеспечивают получение энергии и т.д. Кроме того, болезнетворные бактерии могут обладать ферментами, выполняющими функцию факторов патогенности, например, гиалуронидаза расщепляет основное вещество соединительной ткани, фибринолизин участвует в растворении кровяных сгустков, что способствует распространению возбудителя в организмеферменты обладают высокой специфичностью и многообразием у микробов. По индивидуальному набору ферментов (биохимическим свойствам) часто определяют вид микроба. Наибольшее значение при идентификации бактерий имеет определение сахаролитических и протеолитических свойств. При этом изучаемый микроорганизм помещают в питательную среду, содержащую субстрат (углевод или белок) и индикатор. О наличии фермента судят по изменению цвета индикатора, который реагирует на продукты разложения субстрата. Микробные ферменты широко используют в биотехнологии и медицине. С их помощью осуществляют генно-инженерные Исследования, получают биологически активные вещества, вакцины, сыворотки. В медицине, например, для улучшения пищеварения применяют амилазу и диастазу из аспергиллов, для заживления ран (ожогов) • коллагеназу из клостридий. Метаболизм и культивирование микроорганизмов. Особенности питания бактерий состоят в том, что питательные вещества поступают через поверхность клетки, метаболические
процессы протекают очень быстро и также быстро они адаптируются к меняющимся условиям среды. Типы питания. Для нормального роста и размножения микробам, как и другим существам, нужны органогены (углерод, азот, водород и кислород). Источником водорода и кислорода является вода и некоторые газы (кислород, аммиак, сероводород). По усвоению углерода бактерии делят на аутотрофы и гетеротрофы. Аутотрофы используют углерод неорганических соединений (в том числе углекислоту), гетеротрофы (органотрофы) - углерод органических (углеводы, белки и др., которые часто добавляют в питательные среды для, выращивания микробов). Микробы, усваивающие мёртвые, остатки органических и неорганических веществ, называют сапрофитами. Тех, которые живут за счет органических соединений животных или растений, относят к паразитам.
По усвоению азота бактерии делят на аминоаутотрофы (используют азот воздуха, азотофиксируюшие) и аминогетеротрофы (используют азот белковых соединений, среди них - все паразиты и многие сапрофиты). Многие микробы нуждаются дополнительно в факторах роста (витаминах, аминокислотах, пуринах и пиримидинах, микроэлементах), которые должны поступать в клетку из питательной среды в готовом виде.
Механизм питания. Поступление в клетку питательных веществ является сложным физико-химическим процессом, который может осуществляться посредством 4-х механизмов:
1) пассивная диффузия - если концентрация снаружи выше, чем внутри клетки (по градиенту концентрации);
2) облегчённая диффузия - с участием пермеаз, когда вещества поступают в неизменном виде (по градиенту концентрации);
3) активный транспорт - с участием пермеаз и в неизменённом виде, но обязательно с затратами энергии (АТФ), т.к. это перенос против градиента концентрации;
4) транслокация радикалов - с участием пермеаз идёт активный перенос химически изменённых молекул, т.к. в целом виде они не способны проходить через мембрану.
По источникам энергии различают фототрофы, которые используют энергию солнечного света, и хемотрофы, получающие энергию за счет химического окисления веществ.
Дыхание (биологическое окисление) у бактерий тесно связано с питанием и дает энергию для осуществления функций клетки. При этом в ходе биохимических реакций образуется АТФ -универсальный аккумулятор и переносчик химической энергии у живых существ. Различают аэробный и анаэробный типы дыхания. Микробы, окисляющие органические соединения с использованием кислорода воздуха (в качестве акцептора ионов Н+), называют аэробами. В отличие от них, анаэробы получают энергию в ходе окислительно-восстановительных реакций, при которых акцептором Н+ является не кислород, а нитрат или сульфат (в бескислородных условиях). Многие микробы, имея полный набор дыхательных ферментов, могут существовать как в кислородной, так и бескислородной среде - это факультативные (необязательные) анаэробы с нитратным типом дыхания. Облитатные (обязательные) анаэробы существуют лишь в строго анаэробных условиях, т.к. в аэробных условиях образуются токсичные перекиси (Н2О2 и др.), которые не разрушаются из-за отсутствия у облитатных анаэробов фермента каталазы, для них характерен сульфатный тип дыхания. Необходимыми условиями идя культивирования микробов являются.
1) наличие подходящей по составу питательной среды;
2) оптимальной (по содержанию О2 и др.) атмосферы над питательной средой;
3) оптимальной температуры.
Микробы, относимые к облигатным паразитам, наиболее требовательны к условиям выращивания. Многие из них (из-за отсутствия или дефекта собственных метаболических систем) могут размножаться только в живых клетках (вирусы, риккетсии, хламидии). Для их культивирования заражают животных, куриные эмбрионы или растущие в искусственной среде клетки эукариотов (культуры ткани). Многие микробы растут на естественных (молоко, картофель и т.д.) или искусственных мигательных средах.
Питательные среды,предназначенные для культивирования микробов и изучения их свойств должны отвечать следующим требованиям:
1) достаток питательных веществ (источников органогенов, солей и т.д.);
2) стерильность (без этого трудно выделить чистую культуру, изучать ее свойства)
3) оптимальное значение рН и буферность (противодействие сдвигу рН);
4) оптимальный окислительно-восстановительный потенциал (например, для анаэробов - низкий);
5) изотоничность (как у 0,9% раствора хлорида натрия);
6) влажность (для плотных сред);
7) прозрачность (для жидких сред);
6) определенная вязкость для плотных и полужидких сред (зависит от количества добавляемого агар-агара). Искусственные питательные среды делят на: простые (основные) и сложные. На простых средах (пептонный бульон - ПБ, питательный агар - ПА,) растут многие микробы, их потребности удовлетворяются простым набором питательных веществ (мясной, рыбный или дрожжевой экстракт и пептон). Пептон является продуктом ферментативного расцепления белка, источником аминокислот. В экстрактах, помимо аминокислот и пептидов, содержатся витамины, соли, микроэлементы. Сложные среды в зависимости от назначения делят на специальные, элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические; все они, как правило, содержат дополнительные компоненты. Специальные среды имеют добавки, обогащающие среду факторами роста, и предназначены для высоко требовательных микробов. Например, стрептококки не растут на ПА, для них нужны специальные среды - сахарный бульон (ПБ + глюкоза) или кровяной агар (ПА + кровь); менингококки не растут на сахарном бульоне, но хорошо растут на сывороточном агаре (ПА + сыворотка крови). Стафилококки, кишечная палочка и другие, менее требовательные микробы, растут и на простых средах и на многих специальных. На элективных средах растут микробы преимущественно одного вида. Рост других подавляется под влиянием специальных добавок (антибиотиков, желчи; щёлочи и др.) или из-за обеднённого состава среды. Эти среды используют для выделения чистых культур или накопления микробов определенных видов (сальмонеллы - в жёлчном бульоне, стафилококки - в солевом бульоне, холерные вибрионы - на щелочной пептонной воде и т.д.).
На дифференциально-диагностических средах один вид микроба можно отличить от другого по характеру роста и биохимическим свойствам. Их также используют при выделении чистых культур из смеси микробов или при идентификации выделенной культуры. Например, в состав среды Эндо кроме питательной основы входит лактоза, и индикатор фуксин (обесцвеченный). Микробы, не ферментирующие лактозу, не изменяют цвет среды, в расщепляющие лактозу окрашивают среду Эндо в красный цвет. Среды Гисса содержат набор углеводов и пептоны, которые предназначены для изучения сахаролитических и протеолитических ферментов в ходе идентификации микробных культур.
Рост и размножение бактерийявляются результатом биосинтеза клеточных компонентов. Рост - это увеличение размеров особи и воспроизведение всех её структур. Размножение бактерий происходит путем бинарного деления. Перед делением в клетке удваивается нить ДНК и обе копии генома равномерно распределяются между двумя дочерними клетками. Время от одного деления до другого (время генерации) составляет у многих микробов 20-30 мин , у некоторых - до 20-30 ч (микробактерии туберкулёза) или более. Особенности роста и размножения микробов, их культуральные свойства, учитывают при идентификации, в производстве вакцин и биопрепаратов из микробов.
Культуральными свойствами называют- способность микробов расти на определенных средах с образованием характерного роста (скоплений). По мере размножения в жидкой среде одни микробы образуют помутнение, другие -плёнку или осадок, которые могут появиться уже через 18-24 ч после посева. На плотной среде в месте посева (на поверхности или внутри питательного агара) бактерии могут образовывать типичные колонии; макроскопические скопления микробов одного вида - потомство одной микробной клетки. У разных микробов колонии отличаются по размеру, форме, рельефу, прозрачности, консистенции и цвету. Окрашенность микробных скоплений связана со способностью некоторых видов на свету продуцировать пигменты. Среди них известны водорастворимые (пиоцианин синегнойной палочки, окрашивает и колонии и среду), растворимые в органических растворителях (продигиозан серраций) и нерастворимые пигменты (липохромы стафилококков). Пигменты могут защищать бактерии от действия солнечной энергии, обладать антимикробным действием. В процессе роста и размножения микробы могут продуцировать токсины, витамины, аминокислоты, ароматические и многие другие вещества в значительных количествах. Это используется при биотехнологическом получении полезных для человека продуктов микробного синтеза.
В ходе культивирования на плотных питательных средах может осуществляться выделение чистых культур бактерии, которое должно предшествовать их идентификации. Для этого обычно при посеве механически разобщают (распределяют) микробные клетки по поверхности или в глубине плотной питательной среды. В результате такого посева на месте отдельно лежащих клеток образуются изолированные колонии. Часть такой колонии отсевают на новую питательную среду для накопления выделенной чистой культуры.
Выделение чистой культуры бактерий-аэробов занимает 3 дня:
1день:
а) микроскопия мазка из материала (для ориентировочного суждения о составе микрофлоры);
б) посев материала на ПА в чашке истощающим штрихом (для получения изолированных колоний);
в) инкубирование в термостате (37°С)
2 день:
а) изучение и выбор изолированных колоний;
б) микроскопия мазков из изолированных колоний для суждения об однотипности микробов в колонии;
в) пересев остатка колонии на скошенный ПА (для накопления чистой культуры);
г) инкубирование в термостате (37°С).
3 день:
а) микроскопия мазков из чистой культуры на скошенном ПА (для контроля чистоты просматривают не менее 40 полей зрения);
б) изучение других свойств выделенной чистой культуры.
Выделение чистой культуры анаэробов занимает 4 дня и отличается тем, что исследование ведут в анаэробных условиях на специальных средах и материал предварительно подращивают сутки в среде для накопления анаэробов. Методы культивирования анаэробов основаны на удалении кислорода из питательной среды и из атмосферы (используют механическое и физическое удаление или замещение, химическое или биологическое связывание О2)
- перед посевом среды регенерируют (кипятят и быстро охлаждают);
- делают посевы в высокие столбики среды в пробирках;
- наслаивают поверх питательной среды вазелиновое масло;
- культивируют в анаэростате, из которого удален воздух и (замещен инертным газом или бескислородной смесью);
- культивируют в «Газ-паке» или в эксикаторе, в которые помещены химические поглотители кислорода (например, щелочной раствор пирогаллола и др.);
- культивируют в герметично закрытой чашке с плотной, средой, на две половины которой отдельно засевают анаэробы и аэробы, которые в ходе размножения поглощают кислород (метод Фортнера).
Генетика бактерий.
Микроорганизмы послужили удобной моделью для генетических исследований, приведших к важнейшим открытиям 20 века в биологии: показано, что материальным носителем (основой) наследственности являются нуклеиновые кислоты - ДНК и РНК; установлено детальное строение хромосомы; расшифрованы механизмы: генетического обмена и его регуляции, достижения генетики микроорганизмов послужили основой для становления и развития новой перспективной отрасли биотехнологии. Она призвана использовать свойства микробов и клеточных культур, биологических процессов в производстве: биологически активных веществ (антибиотиков, гормонов, белков, аминокислот), энергоносителей, полезных новых видов микробов, сортов растений, видов животных, эффективных вакцин, а также в борьбе с загрязнением окружающей среды и болезнями растений.
Микробы, как объекты генетических исследований, обладают рядом преимуществ: бактерии содержат гаплоидный набор генов, поэтому изменения их генотипа с неизбежностью влекут за собой изменение фенотипа; для них характерно быстрое размножение и огромная численность потомства (быстрая смена поколений); работа с микробами не требует больших затрат.
Организация генетического материала бактерий.
Геном бактерий (совокупность всех генов) представлен: хромосомой, плазмидами и транспозируемыми элементами (транспозонами), причем обязательным генетическим элементом является только хромосома. Хромосома и плазмиды являются репликонами - элементами, способными к автономной репликации (самоудвоению).
Хромосома представляет собой замкнутую в кольцо двухспиральную нить ДНК, плотно уложенную в цитоплазме и несущую 95-99% генетической информации (дыхание, питание и другие важнейшие функции). Последовательность нуклеотидов в хромосоме определяет чередование оперонов, функционирование которых происходит также, как у других организмов.
Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы, представляющие собой замкнутые в кольцо двухспиральные молекулы ДНК, обычно находящиеся в скрученном состоянии в цитоплазме или в интегрированном состоянии (в составе хромосомы). Они кодируют 1-5% генетической информации (основном, адаптационные свойства), могут утрачиваться клеткой без потери жизнеспособности, а также передаваться от клетки-донора в клетку-реципиент. Трансмиссивные плазмиды передаются путем самопереноса при конъюгации, нетрансмиссивные - пассивно, путем трансдукции с участием умеренного бактериофага или при мобилизации трансмиссивной плазмидой в ходе конъюгации. Плазмиды могут содержать гены множественной лекарственной устойчивости (R - фактор),вирулентносги (плазмиды токсигенности, адгезивности и др.), дополнительных ферментов метаболизма (утилизация лактозы, цитрата и др.). Плазмиды наделяют клетку дополнительной генетической информацией, которая дает ей селективные преимущества (например, способность сохраняться вовнутренней среде макроорганизма, где на микроб действуют защитные реакции организма и антибиотики, принимаемые в ходе лечения).
Транспозируемые элементы - это отдельные фрагменты ДНК, способные к многократному перемещению от одного репликона к другому без изменения структуры. Они не способны к автономной репликации (удваиваются вместе с хромосомой и плазмидой), могут перемещаться (в составе плазмиды) от клетки-донора в клетку-реципиент, вызывая изменение ее генотипа. Различают вставки-последовательности, не кодирующие известных признаков, и транспозоны, кодирующие I или несколько признаков (любых). Перемещение, в зависимости от вида элемента, может происходить в разные или в определенный участок репликона, что также является важным механизмом изменчивости микробов.
Изменчивость микроорганизмов.
Различают: генотипическую (наследуемую) изменчивость и фенотипическую (ненаследуемую, модификационную).
Наследуемая изменчивость осуществляется в виде мутаций и рекомбинаций.
Мутации- это перегруппировка генов, не связанная с внесением в клетку нового генетического материала, ненаправленное изменение генотипа. Спонтанные мутации возникают без видимых причин, как ошибки репликации; индуцированные - под влиянием мутагенов (УФО, ионизирующей радиации, алкилирующих агентов, азотистой кислоты, аналогов оснований ДНК и др.). Мутации могут проявляться в виде удвоения, выпадения, замены нуклеотидов, вставки (в том числе транспозируемого элемента) и др.
Рекомбинации - это изменения генотипа, связанные с внесением в клетку-реципиент генетического материала от клетки-донора. Различают 3 вида рекомбинаций: трансформацию, трансдукцию, конъюгацию.
Трансформацией называют процесс: поглощения клеткой-реципиентом изолированной ДНК клетки-донора (или синтетическойнуклеиновой кислоты).
Трансдукцш - перенос генетической информации (ДНК) при проникновении в клетку умеренного бактериофага (вирусных частиц, паразитирующих на бактериальных клетках). Конъюгация - перенос генетической информации посредством трансмиссивных плазмид при непосредственном контакте донора и реципиента.
Мутации и рекомендации обеспечивают высокий уровень генетического обмена в различных микробиоценозах, позволяют микробам быстро адаптироваться к меняющимся условиям среды, эволюционировать, нередко приобретая нежелательные свойства - лекарственную устойчивость, повышенный патогенный потенциал. Все формы наследуемой изменчивости активно используются в генно-инженерных исследованиях и биотехнологии.
БАКТЕРИОФАГИ.
БАКТЕРИОФАГИ- вирусы бактерий, которые обладают способностью лизировать бактериальную клетку или изменять ее свойства. Фаги размножаются в клетках чувствительных к ним бактерий.
Средние размеры фагов - 25-110 нм.
Но характеру взаимодействия с чувствительной клеткойфаги различают:
а) вирулентные (дают литическую продуктивную инфекцию);
б) умеренные (вызывают лизогенизацию клетки).
Пo специфичности различают:
а) полифаги (лизируют несколько видов бактерий);
б) монофаги (лизируют только один вид бактерий);
в) типовые фаги (лизируют не все штаммы данного вида, а лишь
некоторые, принадлежащие к одному фаговару).
Этапы взаимодействия вирулентного фага с клеткой:
1. Адсорбция фага на специфических рецепторах клеточной стенки (с участием фибрилл и отростка).
2.Проникновение нуклеиновой кислоты фага внутрь бактериальной клетки (лизоцим отростка фага растворяет клеточную стенку бактерии в месте адсорбции, чехол сокращается, стержень проходит сквозь клеточную стенку и нуклеиновая кислота фага поступает внутрь бактериальной клетки, оболочка головки остается снаружи).
Синтез в клетке компонентов фага (проникшая нуклеиновая кислота фага вызывает полную перестройку метаболизма клетки; на рибосомах синтезируются белки фага, а в других участках клетки реплицируется его нуклеиновая кислота). 4. Сборка фаговых частиц и лизис клетки (нуклеиновая кислота наполняет белковые головка, пристраивается отросток; лизоцим фага растворяет клеточную стенку бактерии, клетка лизируется, и из нее выходят 100-300 новых фагов; они внедряются в соседние клетки и также лизируют их; в результате мутная культура бактерий на жидкой среде просветляется, а на плотной среде образуется колония фага - "стерильное пятно").
Взаимодействие умеренного фага с клеткой.
Адсорбция фага и проникновение нуклеиновой кислоты происходит аналогично. Но проникшая в клетку ДНК фага и страивается в хромосому клетки, где может находиться в неактивном состоянии (под действием белка-репрессора) и
наследоваться дочерними клетками после репликации хромосомы. Этот процесс называется лизогенизалией, а клетки, содержащие неактивный геном фага (профаг), называются лизогенными. Чтобы обнаружить в клетке профаг, надо подействовать индуцирующими агентами физическими (УФО, рентгеновскими лучами) или химическими. Они разрушают репрессор, с профага считывается информация, в клетке синтезируются компоненты фага и клетка лизируется. Этот процесс называется индукцией. В процессе лизогенизации может произойти конверсия фагом (изменение свойств бактериальной клетки). Так, если нетоксигенную дифтерийную палочку (не продуцирующую экзотоксин) обработать умеренным дифтерийным фагом, некоторые клетки станут лизогенными и приобретут способность продуцировать экзотоксин.
Титрование фагов.
Активность препарата фага определяется его титром. Титр фага -наибольшее его разведение, еще вызывающее лизис чувствительной культуры бактерий. Фаги титруют следующими методами.
1. Титрование фага, на жидкий среде. Готовят последовательные десятикратные разведения испытуемого фага в жидкой питательной среде: 10-1, 10-2, 103, и т.д. В эти разведения вносят чувствительную культуру бактерий. Пробирки инкубируют в термостате при 37QC 18-20 часов. Затем отмечают наибольшее разведение фага, ещё вызывающее лизис внесенной культуры (рост бактерий в этой пробирке отсутствует). Это разведение, и является титром фага. Например: "титр фага- 10-6
2. Титрование фага на плотной среде.
Чашку с плотной средой делят на несколько зон. Культуру чувствительных бактерий высевают сплошным газоном на поверхность среды. Затем в соответствующие зоны наносят по капле различных десятикратных разведений фага. После инкубации в термостате при 37°С 18-20 часов отмечают наибольшее разведение фага, еще вызывающее лизис (образование "стерильного пятна").
Практическое применение вирулентных фагов:
1) для лечения и экстренной профилактики (при угрозе заражения). Например:
-брюшнотифозный
- дизентерийный
- холерный Эль-Тор,
- коли - протейный,
-стафилококковый,
- гангренозные,
- синегнойный и др.
2) для диагностики (с целью установления вида неизвестного микроба). Например: испытуемый микроб высевают сплошным газоном на чашку с плотной средой, на которую наносят каплю известного видового фага и инкубируют в термостате. Если культура бактерий ' соответствует данному фагу, образуется "стерильное пятно".
3) для фаготипирования с целью установления источниказаражения (применяются типовые фаги). Если штаммы,выделенные от больного и предполагаемого источникализируются одними и теми же типовыми фагами (принадлежат кодному фаговару), это подтверждает общность ихпроисхождения.
Применение умеренных фагов:
1) на лизогенных бактериях изучают механизмы функционирования различных генов; с помощью трансдукции устанавливают локализацию генов на бактериальной хромосоме.
2) лизогенные бактерии попользуются при поисках противоопухолевых веществ: если препарат обладает индуцирующими свойствами, значит он, взаимодействует с нуклеиновыми кислотами, и его можно испытывать как противоопухолевый препарат.
3) лизогенные штаммы используют при изучении различных мутагенных факторов, например, в космических исследованиях как индикаторы надежности защиты космических кораблей от жестких космических лучей: если по возвращении из космоса произошла индукция, и культура лизировалась, это означает, что в корабль проникли космические лучи, т.е. защита корабля ненадежна.
4) умеренные фаги широко используются в генной инженерии.Модель "профаг - клетка" лежит в основе вирусогенетической гипотезы происхождения опухолей.
МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ ГРИБОВ, АКТИНОМИЦЕТОВ, СПИРОХЕТ И ПРОСТЕЙШИХ.
Грибы - это одноклеточные или многоклеточные эукариоты без хлорофилла, но близкие к растениям. Патогенные для человека грибы имеют следующие морфологические формы:
1 - гифы (нити), которые при сплетении образуют мицелий (тело гриба).
Различают:
а) истинный (у плесеней) - трубка, разделённая или неразделённая перегородками (септами), покрытая общей оболочкой;
б) ложный (псевдомицелиий, у грибов рода Кандида - Candida) вытянутые, нитевидные клетки, каждая из которых имеет свою оболочку.
2 - круглые и овальные почкующие клетки (у дрожжей и грибов рода Кандида). Размеры вегетативных форм - xl - х!00 мкм. Структура их сложная: многослойная клеточная стенка, цитомембрана, дифференцированное ядро, полисомы, митохондрии, включения, пигменты.
3 - споры (по назначению и свойствам они отличаются от спор бактерий: у грибов это форма размножения и распространения; споры гриба менее устойчивы к высокой температуре). Различают:
а) эндоспоры, покрытые оболочкой. Например, аски у дрожжей, образующиеся в результате полового размножения;
б)экзоспоры; контактируют с воздухом. Например, микроконидии у гриба Пенициллиум (Penicillium).
Способы размножения грибов:
1 - поперечное деление;
2 - фрагментация;
3 - почкование;
4 - спорообразование;
5- половой способ.
По типу дыхания грибы - аэробы и факультативные анаэробы, потипу питания - гетеротрофы. Для выращивания грибовприменяют среду Сабуро (дрожжевой экстракт + глюкоза +пептон + агар-агар), рН=6,8Срокироки роста - от 2-3 дней до месяца Характер колоний различен:беловато-желтые, напоминающие капли сметаны, пушистые,морщинистые, гипсовидно-мучнистые, кожистые, с различнымибороздками, пигментами. По отношению к питательной средеразличают мицелий:
воздушный (репродуцирующий), на концах которогорасполагаются споры, и субстратный, врастающий в питательнуюсреду.
Среди патогенных грибов известны двухфазные грибы. Этогрибы разной морфологии в зависимости от локализации: ворганизме человека это обычно дрожжевая форма, а на средеСабуро - мицелиальная. К ним относятся возбудители особоопасных микозов: гистоплазмоза, кокцидиоидного микоза идругих заболеваний.
Токсинообразование: большинство грибов образуют эндотоксин,некоторые - экзотоксин. Грибы подразделяют на две группы.
1 Низшие грибы.Для медицины и фармации важны 2 класса:
-зигомицеты (вызывают болезни лекарственных растений); -оомицеты (например, мукоровая плесень - вызывает мукоз у людей и животных).
2. Высшие грибы. Представляют интерес 2 класса:
-совершенные грибы - аскомицеты (наиболее характерен половой способ размножения); а) плесени б) дрожжи в) возбудитель гистоплазмоза
-несовершенные грибы - дейтеромицеты (половой способ менее характерен):
а) грибы рода Кандида
б) возбудители дерматомикозов (поражают кожу и ее придатки -волосы, ногти).
Значение грибов:
1. Патогенные грибы вызывают у человека микозы.
2. Грибы широко используются в биотехнологии: как продуценты антибиотиков (Penicillium spp.), белков, полисахаридов, витаминов, ферментов; в пищевой промышленности (хлебопечение, сыроварение, изготовление кисломолочных] продуктов). | 3. Грибы используют как объекты в генной инженерии и других; научных исследованиях;
Методы изучения морфологии грибов:
1. В неокрашенном состоянии, в "раздавленной капле" со щёлочью. Щелочь растворяет жир и ороговевшие клетки, после чего можно рассмотреть структуру и элементы грибов в пораженных тканях.
2. В окрашенном состоянии в чистой культуре (красят чаще простым способом).
3. В окрашенных и неокрашенных гистологических срезах.
4. В люминесцентном микроскопе после обработки флюорохромами, используя вторичную люминесценцию.
Актиномицеты- это прокариоты, относящиеся к бактериям и, составляющие самостоятельную группу микроорганизмов. Основные свойства (форма, строение, размножение, культивирование, чувствительность к антибиотикам) сближает их с бактериями. Но есть свойства (мицелий, размножение при помощи спор, характер заболевания - актиномикоза), сближающие с грибами. Значение для человека:
1. Многие актиномицеты являются продуцентами антибиотиков.
2. Патогенные актиномицеты вызывают у человека актиномикоз. Заразиться можно от животных и при жевании травинок, колосков (актиномицеты являются свободно живущими микробами). Возможен эндогенный путь инфицирования тканей (возбудитель живет в десневых карманах здоровых людей). Чаще развивается актиномикоз шейно-челюстной области, что приводит к образованию воспалительных уплотнений со свищами, из которых выделяется жидкий гной с зернышками -друзами (это скопление актиномицетов, окруженные колбовидными вздутиями клеток паразита). Обнаружение друз -диагностический признак актиномикоза.
Спирохеты- это прокариоты, относящиеся к бактериям. Спирохеты имеют следующие особенности:
I. Форма - извитая, как у спирилл.
2 Строение: имеется податливая клеточная стенка,
цитомембрана, нуклеоид, миофибриллы.
3. Размножение - поперечным делением.
4. Имеют черты, сближающие их с простейшими:
а) передвижение происходит при помощи миофибрилл, чтообеспечивает их движение - поступательное, сгибательное,вращательное, маятникообразное ,
б) окрашивание по Романовскому-Гимзе;
в) заболевание по характеру течения напоминает протозойные(вызванные простейшими);
г) сходные механизмы заражения (в том числе наличие переносчиков - членистоногих);
д) чувствительны к антибиотикам и к препаратам, применяемым для лечения протозойных заболеваний.
Спирохеты грамотрйцательны. По типу питания - гетеротрофы. По типу дыхания боррелии и трепонемы - анаэробы, а лептоспиры - аэробы.
Патогенные спирохеты относятся к 3 родам:
1 Род Боррелия (имеют 3-5 неравномерных завитков): а) возбудитель эпидемического вшивого возвратного тифа В..recurrentis);
б) возбудители клещевых возвратных тифов - (B.caucasica). Культивируется плохо (на культурах тканей, на средах с
сывороткой и кусочками тканей)
2. Род Трепонема (имеют 8-12 равномерных завитков, в виде пружины) возбудитель сифилиса - (бледная трепонема), Т. pallidum. Культивируется в яичке кролика. 3. Род -Лептоспира (имеют множество мелких завитков; концы загнуты и имеют утолщения). Патогенные лептоспиры
относятся к виду - L. interrogans. Культивируются на среде Улентута (водопроводная вода + 30% кроличьей сыворотки). Морфологию спирохет обычно изучают в неокрашенном состоянии, наблюдая подвижность в ультрамикроскопе или в окрашенном состоянии (чаще по Романовскому-Гимзе).
Простейшие - это эукариоты, близкие к животным клеткам. Размеры от 4 до 200 мкм. Форма - округлая, овальная, полу лунная, грушевидная и т.д. У некоторых простейших тело покрыто относительно тонкой мембраной (амёба), у других -более плотной эластичной оболочкой - пелликулой (балантидии), у жгутиковых - перипластом (пелликула + слой продольных фибрилл). В цитоплазме располагаются 1, иногда 2 ядра (микро-и макровнуклеусы балантидии), полисомы, митохондрии, включения, вакуоли и др. У некоторых в цитоплазме лежи скелетная органелла - аксостиль. Отдельные простейшие имею специальные органеллы: прикрепления (присоска у лямблий), проникновения (у токсоплазм), пищеварения (у балантидии). Движение простейших осуществляется с помощью: -псевдоподий (амеба);
- жгутиков (лямблии);
- ресничек (балантидии). По типу питания - гетеротрофы. Среди них есть абсолютные паразиты: (плазмодии, токсоплазмы и др.) В неблагоприятных условиях могут образовываться цисты - скопления из несколь особей, покрытых общей оболочкой. По типу дыхания большинство факультативные анаэробы. Механизм питания:
1. Всей поверхностью тела по типу фшхщитоза и пиноцитоза (амеба).
2. Посредством специальных органелл пищеварения (балантидии).
Простейшие чувствительны к дезинфицирующим растворам(цисты более устойчивы). Для многих простейших характернастадийность развития, переход от одного хозяина к другому,причем в организме определенных хозяев проходит половой циклразвития.
Размножение осуществляется:
- простым делением (амеба);
- множественным делением (шизогония у плазмодия);
- половым способом (конъюгация или копуляция).
Классификация простейших:
1. Класс корненожек (возбудитель амебиаза др.).
2. Класс жгутиковых (возбудители трихомоноза, лямблиоза, лейшманиоза, сонной болезни и др.).
3. Класс споровиков (возбудители малярии, токсоплазмоза, криптоспоридиоза и др.).
4. Класс ресничные (возбудитель балантидиаза и др.).
Морфологию простейших изучают:
-в неокрашенном состоянии (в препарате "раздавленная капля из свежего материала на подогреваемом столике микроскопа),
-в окрашенных препаратах (по Романовскому-Гимзе и др.).