Реакции иммунитета

Реакциями иммунитета /серологическими реакциями/называют действие между антигенами и антителами, ведущее кобразованию иммунного комплекса /антиген-антитело/. Онипротекают, как правило, в 2 фазы в присутствии дополнительногофактора /электролит, комплемент, фагоцит илидр.

Специфическая фаза /невидимая: "химическая"/ происходиточень быстро и характеризуется соединением детерминантнойгруппы антигена с активным центром антитела. В результатеобразуется комплекс, утрачивающий растворимость визотонических растворах /например, в растворе хлорида натрия./

Неспецифическая фаза /видимая, "коллоидная"/ наступаетчерез несколько минут или часов и характеризуется укрупнениемкомплекса антиген+антитело с изменением его физическихсвойств. Эта фаза сопровождается видимыми феноменами:выпадением осадка, образованием хлопьев, просветлениемвзвеси, остановкой движения частиц и др.

Реакции иммунитета высокоспецифичны и их широко применяютНа практикедля серодиагностики инфекций /по обнаружению антимикробныхв сыворотке крови/, определения вида и варианта

микроба по антигенной структуре, определения других антигенов/аллергенов, гормонов, биологических образцов разногопроисхождения /.

Области применения реакций иммунитета:

диагностика инфекционных и неинфекционных заболеваний, фармация, санитарно-ветеринарная служба, трансплантация органов и тканей /в т.ч. крови/, судебная медицина. Реакция агглютинации /РА/ - это взаимодействие корпускулярного антигена /взвеси бактерий, других "клеток или: частиц/ и антител-агглютинов в изотоническом растворе с образованием и осаждением агглютината /хлопьев из склеившихся частиц/. Ее ставят несколькими методами. Быстрая ориентировочная РА ставится на предметном стекле к учитывается в течение 2-3 мин после смешивания ингредиентов и покачивания стекла- Более надежные результаты дает использование адсорбированных и монорецепторных сывороток, что позволяет избежать неспецифических реакций, например, с родственными бактериями за счет общих антигенов. Развёрнутая /объёмная/ РА более точна, она ставится в пробирках и учитывается через сутки- В ряду пробирок готовят последовательные двукратные разведения сыворотки в ИХН -1:50, 1:100, 1:2О0, 1:400 и т.д. Затем в каждую пробирку добавляют одинаковое количество взвеси клеток, встряхивают и ставят при комнатной температуре. Результат учитывают по характеру осадка и просветлению надосадочной жидкости. Титром агглютинирующей сыворотки считают её максимальное разведение, при котором наблюдается выраженная реакция. РА используют для идентификации микробов по антигенной структуре, для определения антимикробных антител и их титра в сыворотке при серодиагностике инфекционных заболеваний, при определении группы крови и т.п.

Реакция пассивной /непрямой/ гемагглютинании /РПГА/ является разновидностью непрямых агглютинационных реакций, наряду с реакцией коагглютинадии, агглютинации латекса и др. Эти реакции более чувствительны, чем РА, т.к. предварительно стандартный антиген /или антитело/ присоединяют к корпускулярному носителю - эритроцитам, убитым микробам или частицам латекса, получая, соответственно, эритроцитарные, коагглютинирующие или латексные диагностикумы /антигенные или иммуноглобулиновые/. РПГА. с антигенным эритроцитарным диагностикумом ставят в пробирках или лунках планшета с двукратными разведениями сыворотки /например, с целью серодиагностики инфекций и леи выявления напряжённостииммунитета - по титру антител/. При положительной реакции через 4-20 ч формируется рыхлый осадок эритроцитов на всей площади дна пробирки или лунки При отрицательной реакции эритроциты образуют плотный осадок в центре /в виде пуговицы/. РПГА с иммуноглобулиновыми диагностикумами учитывают так же, но её ставят для быстрой индикаций возбудителя в исследуемом материале или его идентификации по антигенной структуре. Это метод экспресс-диагностики.

Реакция преципитации /РП/ это выпадение в осадок растворимого антигена при взаимодействии с соответствующими антителами-преципитинами в присутствии электролита. Антигеном может быть прозрачный раствор белка или гаптена различные экстракты. РП ставят несколькими методами. Метод кольцепреципитации: на диагностическую сыворотку с известными преципитинами в узкой пробирке сверху осторожно наслаивают раствор антигена и в течение часа учитывают положительную реакцию /на границе жидкостей образуется белый диск преципитата и постепенно, оседает/, Так определяют, например, антиген возбудителя сибирской язвы в разных материалах. Метод преципитации в капилляре: стеклянный капилляр диаметром 1 мм сначала опускают на 1/3 в диагностическую сыворотку, а затем на 1/3 - в раствор антигена, переворачивают несколько раз и оставляют в вертикальном положении на сутки. Зёрна преципитата оседают и собираются столбиками на нижнем мениске жидкости в капилляре. Так определяют например, С- реактивный белок /СРБ/ при аутоиммунных заболеваниях, ревматизме, туберкулёзе, инфаркте миокарда /диагностическую сыворотку с преципитинами к СРВ получают путем иммунизации кроликов/. Методы диффузной преципитации в агаровом геле; растворы антигенов и антител помещают в разные места прозрачного геля, из которых они диффундируют, образуя при встрече преципитат в виде белых полос или линий. В методе простой диффузии антиген диффундирует в агаре, содержащем определенную концентрацию диагностической сыворотки, которую предварительно вводили в не застывший агар. В методе двойной диффузии антигены и антитела из лунок в агаре диффундируют навстречу друг другу в нейтральном слое агара.

В методе иммуноэлектрофореза раствор неоднородного антигена сначала подвергают фракционированию в агаровом геле под действием постоянного тока а затем канавку в геле, сделанную сбоку от линии распределения фракций заполняют сывороткой /антителами/. В результате двойной диффузии в геле образуется специфический рисунок из дуг к линий преципитата, вид которого зависит от количества и качества фракций антигена и антител.

РП обладает высокой чувствительностью, она позволяет выявлять белковые антигены в разведениях 1:100000 и выше, т.е. недоступных для обнаружения химическим путём. Титром преципитирующей сыворотки считают наибольшее разведение антигена, дающее прецигтитацию при контакте с ней. Такая особенность связана с мелкодисперсным состоянием антигена, малыми размерами его молекул. РП применяют для индикации микробных антигенов в материале от больных и из внешней среды, определения иммуноглобулинов разных классов /диагностика и профилактика инфекций и иммунодефицитов/для выявления фальсификации пищевых продуктов /санитарная практика/, для определения видовой принадлежности крови и других биологических примесей /судебно-медицинская практика/.

Реакция нейтрализации токсина антитоксином /РН/ -серологическая реакция между микробным экзотоксином и антителами, приводящая к инактивации ядовитого действия токсина. Eе ставят в опытах на животных: для обнаружения экзотоксина в исследуемом материале; для определения титра антитоксина в иммунной сыворотке. Например, материал, содержащий экзотоксин, смешивают с известнойдиагностической сывороткой /в избытке/, выдерживают 30 мин и вводят животным. Если сыворотка нейтрализует токсин, отравления и гибели животных нет. Если токсин не соответствует антитоксинам сыворотки, животные погибают /как и в контрольной группе животных, получивших хот же материал без сыворотки/. Для определения антитоксической сыворотки ставят такой же опыт, но берут стандартный экзотоксин известной, силы и смешивают с сывороткой в разных соотношениях. Определяют наименьшее количество сыворотки, нейтрализующее определенное число минимальных летальных доз-DLM токсина /это количество соответствует i антитоксической единице, АЕ

сыворотки/. Титр сыворотки выражают количеством АЕ или ME/международных антитоксических единиц/ в i мл сыворотки.Например, 1 ME противодифтерийной сыворотки нейтрализует

100 ДЛМ дифтерийного токсина для морской свинки.Титрование антитоксических сывороток проводят и в пробирках -в реакции флокуляции /разновидность РП/. Оно основано на том,что при смешивании экзотоксина или анатоксина /т.е. белковогоантигена/ с титруемой сывороткой наиболее раннее помутнение/инициальная флокуляция/ наблюдается в пробирке сэквивалентным соотношением токсина /анатоксина/ иантитоксина / т.е. 1 TE(Lf) : 1 АЕ(МЕ) /.

Реакция иммунофлюоресценции /ИФ/ - взаимодействиелюминесцирующих антител с корпускулярным антигеном иобразование светящегося иммунного комплекса. Метод основанна способности иммуноглобулинов прочно соединяться сфлюорохромами /ФИТЦ, акридиновым оранжевым и др./ безпотери специфичности. Под действием ультрафиолетафлюорохромы дают вторичную люминесценцию. В прямомметоде ИФ на предметном стекле готовят и фиксируют мазок изантигенсодержащего материала, наносят на неголюминесцирующую сыворотку /например, противочумныеантитела, меченные ФИТЦ/. После 30-минутного контактапрепарат тщательно промывают и изучают под люминесцентныммикроскопом. Клетки чумного микроба в исследуемом материалесветятся по периферии желто-зеленым цветом. ИФ протекает в 1

фазу и обладает рядом достоинств: высокочувствительна, простав постановке, может использоваться как метод экспресс-диагностики /ответ в течение 1-2 ч/. Её используют для быстрого

обнаружения микробов в исследуемом материале, а также для ихИдентификации.

Иммуноферментный анализ /ИФА/. Основан на использовании антител, меченных ферментом, который проявляет в присутствии субстрата специфическую активность в случае образования Комплекса антиген+антитело, фиксированного на твёрдой основе. ИФА широко используют для определения разнообразных антигенов и антител. Разработано много методов и модификаций

ИФА, выпускаются коммерческие наборы. Для определения антигена в исследуемом материале /сэндвич-метод/ вначале производят сорбцию известных антител на поверхности лунок полистироловой пластины, затем вносят антиген содержащий материал, и, после контакта, тщательно промывают. Затем в лунки добавляют соответствующие антитела /сыворотку/, меченные пероксидазой хрена или другим ферментом, отмывают и добавляют хромогенный субстрат / 5-аминосалициловую кислоту с перекисью водорода или др./.

При положительной реакции в течение 1 часа развивается коричневое окрашивание, интенсивность которого зависит от количества меченных антител, связанных в иммунном комплексе. Для определения неизвестных антител /например, с целью серодиагностики сифилиса или ВИЧ-инфекции/ на поверхности лунок сорбируют известный антиген, затем добавляют исследуемую сыворотку крови, промывают, вносят сыворотку с антителами против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом, и, после вторичной промывки, добавляет хромогенный субстрат. Учитывают так же. ИФА отличается высокой чувствительностью и специфичностью/. * Непрямой метод ИФ отличается тем, что на стекло наносят обычные кроличьи антитела, которые образуют с клетками невидимый комплекс АГ+АТ. Затем препарат промывают и обрабатывают люминесцирующей: сывороткой с ослиными /лошадиными/ AT к кроличьему белку /образуется двойной светящийся комплекс/. Этот метод более экономичен, т.к. используется одна люминесцирующая и набор нелюминесцирующих сывороток.