2.2. Питательные среды
Основными средами для выделения и поддержания выделенных культур молочнокислых бактерий и дрожжей являлись следующие:
1. Среда МRS: дрожжевой автолизат – 5мл, пептон-10 г, глюкоза – 20 г, лимоннокислый аммоний – 2 г, уксуснокислый натрий – 5 г, MgSO4 x 7H2O – 200 г, MnSO4 x 4H2O – 50 мг, K2PO4 – 2 г, твин 80 – 1 мл, агар-агар – 20 г, вода – 1000мл., рН 6,2-6,6.
2. Гидролизат молока (по Богданову); для приготовления которого к 1л прокипяченного и охлажденного стерильного обезжиренного молока (рН =7,4-7,6) добавляли 1 г панкреатина, 5 мл хлороформа. Сосуд закрывали корковой пробкой и ставили в термостат на 72 часа при 40 0С. Полученный гидролизат фильтровали, устанавливали рН 7,0-7,2 и стерилизовали в течение 10 мин, при 1 атм.
2.3. Методы исследований
Выросшие колонии предположительно молочнокислых бактерий микроскопировали и отсевали в пробирки со стерильными жидкими питательными средами (гидролизованное молоко, среда МRS). Пробирки культивировали в термостатах при 30 и 37 0С в течение 24 часов и использовали в дальнейших исследованиях [23].
Изучение культурно-морфологических особенностей микроорганизмов проводили согласно общепринятым методикам. Морфологические особенности микроорганизмов изучали на одно-двух суточных культурах. Из них готовили фиксированные препараты, которые окрашивали по Грамму в модификации – Синева. Также исследовали характер роста, величину, форму, цвет, структуру и консистенцию колоний. Выросшие колонии подсчитывали визуально и под лупой. Изменения морфологии наблюдали в световом микроскопе Axioskop 40 [24, 25].
Физиолого-биохимические свойства молочнокислых бактерий оценивали по таким признакам, как устойчивость к поваренной соли, оптимальная температура, выживание после нагревания, сбраживание углеводов, энергия кислотообразования, время свертывания молока в соответствии с общепринятыми методами [26, 27].
Кислотность анализировали титрованием 0,1N NaOH и выражали в градусах Тернера [24].
Выделение молочнокислых бактерий и дрожжей проводили по схеме, изображенной на рис.1.
Пробы
Десятикратные
разведения
Глубинный посев на питательную среду
│
Микроскопирование Характеристика колоний
Получение изолятов на
обезжиренном
молоке
микроскопирование
посев на среду МRS
Отбор изолятов
получение
микроскопирование
периодические посевы хранение чистых культур
Рисунок 1. Схема отбора изолятов молочнокислых бактерий и дрожжей, выделенных из молочных продуктов.
В стерильное молоко при соответствующей температуре вносили одну петлю исследуемого штамма или закваски в возрасте 18 часов. Молоко тщательно перемешивали и выдерживали в термостате при оптимальной температуре роста для данного вида до образования сгустка. Отмечали продолжительность образования сгустка пробы, оставляли на 1-2 часа при комнатной температуре, после чего помещали в холодильник при +3-+5 0С, на следующий день проводили дегустацию, отмечали характер сгустка, его вкус, запах и консистенцию [26].
Состав заквасок определяли путем микроскопирования и посева соответствующих разведений закваски на молочный гидролизованный агар в чашках Петри и последующем термостатировании чашек при оптимальной температуре 3-5 суток.
Антагонистическую активность бактерий и дрожжей изучали методом диффузии в агар. В качестве тест-культур использовали грамотрицательные бактерии – Escherichia coli, Salmonella dublin, грамположительные бактерии – Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus. Тест-культуры выращивали на средах с оптимальным составом для каждого вида: МПА.
В расплавленную и остуженную среду вносили 0,1 мл суспензии, перемешивали и переливали в чашку Петри. В слое питательной среды вырезали лунки, в которые вносили суточные культуры изучаемых молочнокислых бактерий и ставили в термостат на 24 часа. Через сутки измеряли зоны подавления роста тест – культур молочнокислыми бактериями.
Наблюдения вели ежедневно в течение 3 суток при 280 и 370С. Для выявления наиболее сильной антагонистической активности осуществляли подбор оптимальных условий культивирования молочнокислых бактерий выращиванием на различных питательных средах (гидролизованное молоко и среда МRS) [28].
Для изучения антибиотической резистентности использовали общепринятую методику стандартных индикаторных дисков, пропитанных стандартными растворами стрептомицина, левомицитина, ампициллина, бензилпенициллина, эритромицина, ванкомицина, гентамицина, тетрациклина [29, 30].
В качестве питательной среды для молочнокислых бактерий использовали гидролизованное молоко с агаром. В опытах использовали односуточные культуры, выращенные при оптимальной температуре, в виде суспензии клеток в количестве 1 млрд./мл (по бактериальному стандарту мутности), исходя из расчета 0,1 мл суспензии на одну чашку Петри. Засеяв чашки исследуемыми культурами МКБ, на поверхность питательной среды, укладывали диски, содержащие антибиотики.