Лекции по биофизике

VI. ТРАНСПОРТ ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНЫ

Введение

Биологические структуры относятся к открытым термодинамическим системам, постоянно обменивающимся в течение жизни с окружающей средой не только энергией, но и веществом. Роль биологических мембран – сопряжение и регуляция потоков энергии, вызывающих и сопровождающих процесс транспорта. Поэтому, транспорт веществ через биологические мембраны – необходимое условие для существование жизни. С ним связаны:

метаболизм клетки; биоэнергитические процессы; биоэлектрические потенциалы.

Нарушение мембранного транспорта ведет к возникновению различного типа клеточных дисфункций и патологий.

Классификация видов транспорта

Различают несколько классификаций видов транспорта:

1. Относительно изменения энергии в процессе переноса веществ транспорт подразделяется на активный и пассивный.

Активный транспорт осуществляется с затратой энергии (локальное увеличение свободной энергии, за счѐт гидролиза АТФ) и против градиента концентрации. Более того, он сам создает и поддерживает этот градиент-

первично – активный транспорт.

Если же перенос веществ обеспечивает энергия, обусловленная градиентом ионов, созданным в ходе первично – активного транспорта – вторично – активный транспорт.

Пассивный транспорт осуществляется без затраты энергии, протекает самопроизвольно и по градиенту концентрации. Градиент в процессе пассивного транспорта снижается и сопровождается локальным уменьшением свободной энергии.

2. Относительно количества переноса веществ через мембрану выделяют:

Унипорт – перенос данного вещества (иона) не зависит от наличия и переноса других веществ и котранспорт – перенос данного вещества (иона) зависит от наличия и переноса других веществ. В этом случае скорость суммарного процесса контролируется наличием и доступностью для систем переноса обоих партнеров транспортного процесса.

Котранспорт относительно направления подразделяют на симпорт и антипорт. При симпорте осуществляется однонаправленный и

81

одновременный транспорт, а при антипорте – одновременный, но разнонаправленный перенос веществ.

Рис. 11. Виды транспорта

3. Специфические механизмы переноса веществ, связанные с нарушением структурной целостности мембраны:

эндоцитоз и экзоцитоз – важнейшие процессы жизнедеятельности клетки, механизмы высвобождения медиатора в синаптическую щель, фагоцитоз лейкоцитов и др.

Методы изучения транспорта

1.Осмотический – изменение объѐма клетки при транспорте воды.

2.Химический (цитохимический) – проникновение красителей,

постановка цветных реакций.

3.Биохимический – функция ферментов – участников транспорта,

4.Изотопных меток: углерода (С14), натрия (Na22), рубидия (Rb86) и др.

5.Спектро- и флюорометрический – изменение параметров поглощения и флюоресценции специфических веществ–меток, меняющих свои характеристики после взаимодействия с внутриклеточными структурами,

6.Опосредованные методы – измерение рН, вольтамперных характеристик.

Пассивный транспорт и его виды

Подчиняется закону Фика:

	dm	DS	dc
	dc		dx

Скорость переноса вещества зависит от градиента концентрации – dc/dx, площади (S) и коэффициента (D) диффузии.

Подразделяется на:

1.Простую диффузия.

2.Облегченную диффузия.

82

Рис. 12. Зависимость скорости пассивного транспорта от концентрационного градиента:

1 – простая диффузия;

2 – облегченная диффузия.

Простая диффузия отличается отсутствием специальных систем для переноса веществ. Подчиняется правилам Овертона: Скорость проникновения через мембрану прямо пропорциональна липотропности вещества и обратно пропорциональна – его размерам.

Позднее Колландер из уравнения Фика вывел более удобно выражение для расчета потока (J) поступления веществ в клетку:

J P(c1 c2 ) , где:

с1 и с2- разность концентраций по обе стороны мембраны Облегченную диффузия отличает наличие специфических структур,

способствующих транспорту через мембрану: а) переносчики; б) ионные каналы.

Наличие переносчиков изменяет кинетику транспорта, и она становится сходной с уравнениями ферментативного катализа, только в роли фермента выступает переносчик, в роли субстрата переносимое вещество (S):

	J s	J m ax S
		KT	S ,

где КT- константа транспорта соответствует константе Михаэлиса и равна концентрации S при Js=Jmax/2.

Представители систем облегченной диффузии ионов (симпорт, антипорт) с участием специфических переносчиков:

Na+/Cl—обмен
Na+/Na+--обмен
Na+/H+ – обмен	антипорт – котранспорт
Na+/Ca2+-обмен
Cl-/HCO3-+-обмен
Cl-/ Cl--обмен

K+/Cl—и Na+,K+,2Cl- – симпорт – котранспорт

83

Унипорт

Ионофоры – небольшие гидрофобные молекулы, которые растворяются в липидном слое мембран и увеличивают проницаемость мембран для ионов. Большинство ионофоров синтезируется бактериями (в качестве оружия против своих конкурентов), некоторые являются антибиотиками. Широко используются в клеточной биологии.

Ионофоры делятся на:

1.Подвижные переносчики. Имеют кольцеобразную структуру: наружная часть – гидрофобная и контактируют с липидным слоем; внутренняя часть – гидрофильная содержит карбоксильные атомы кислорода.

2.Каналообразующие. Состоят из линейных полипептидов, которые

имеют гидрофобные боковые цепи. Две таких молекулы образуют канал

Ионные каналы (унипорт) классифицируют:

А) по типу ионов: натриевые, калиевые, кальциевые и хлорные каналы; Б) по способу регуляции (Рис. 13):

1.потенциал-чувствительные

2.хемочувствительные (рецептор-управляемые)

3.внутриклеточными веществами (ионами, ФАВ).

Рис. 13. Классификация ионных каналов по способу регуляции

1-потенциал-чувствительные; 2-хемочувствительные (рецепторуправляемые); 3-АТФ–чувствительные; 4-кальций-зависимые.

Натриевые и калиевые каналы

Размеры ионных каналов меньше одного нм (02-04 нм). Эти структуры обеспечивают важнейшие электрофизиологические свойства клеток и тканей, обеспечивая прохождение в 1с 106-109 ионов, регулируются мембранным потенциалом и БАВ. Через ионные каналы Na+ и K+ следуют совместно с одной молекулой воды – гидратной оболочкой, хотя в растворе у иона таких оболочек может быть несколько (до 10). Таким образом, при прохождении через ионный канал происходит дегидратация катиона, на что требуется энергия. Роль этой энергии выполняет градиент ионов, так как ионный транспорт относится к пассивному виду переноса веществ через мембрану. В

84

процессе переноса катионов должны выполнятся два основных условия (фактора):

1.Стерический – совпадение размеров катиона+гидратная оболочка с размерами канала.

2.Энергетический – взаимодействие катиона с карбоксильными (ОТРИЦАТЕЛЬНО заряженными группировками самого канала).

Кальциевые каналы

Кальциевые каналы делятся на потенциал-зависимые и рецептор– управляемые. Они находятся в плазменной мембране всех электровозбудимых клеток: сердечная и гладкая мышца, мышечные волокна членистоногих, нервная клетка (соматическая, дендрита), эндокринные и иммунные клетки и т.д.

В нормальных условиях внутри клетки [Ca2+]in = 10–7 - 10–6 M

Через кальциевый канал проникают только двух валентные катионы в соответствии с рядом:

pKBa2+ > pKSr2+ > pKCa2+ > pKCo2+ > pKNi2+ > pKCd2+

Из этого ряда следует, что эти катионы в отношении их взаимодействия с кальциевым каналом образуют непрерывный ряд и этот ряд совпадает с рядом их связывания с карбоксильной группой. Предполагают, что селективный фильтр кальциевого канала содержит карбоксильную группу. Все двух валентные катионы, которые связываются с этой группой слабее, чем кальций, проникают лучше (Ba+ и Sr+). Катионы, которые связываются с этой группой

сильнее, чем кальций являются блокторами кальциевых каналов

(Co2+,Ni2+,Cd2+).

Регулирующий центр кальциевого канала, как считают, располагается у устья, где есть связывающая структура, которая взаимодействует с двухвалентными катионами.

В бескальциевом растворе (с добавлением хелаторов Са2+ ЭГТА, ЭДТА) происходит модификация кальциевого канала: они сохраняют потенциалзависимость, но теряют селективность и пропускают ионы натрия. Повидимому, в отсутствии ионов кальция устраняется селективный фильтр у устья канала. В нормальных условиях с этой структурой связан кальций, и в этих условиях канал сохраняет обычную избирательность по отношению к двухвалентным катионам. Если же ионы кальция удаляются из этого центра, то наступает конформационная перестройка канала, что ведет к потере его избирательности, и он начинает работать как обычный натриевый канал.

Модель Х1 иХ1 для натриевых и калиевых каналов применяются и к кальциевым каналам (перемещением заряженной частицы)

Проводимость (g) для кальциевого канала также зависит от активационной (m) и инактивационной частиц (h):

gCa = gCa m2h (для натрия m3)

Ионный ток по закону Ома:

85

ICa =gCa m2h (E – ECa)

Если натриевый ток – быстрый входящий ток, то активация кальциевых каналов происходит медленнее, чем натриевых каналов. Кальциевый ток во многих электровозбудимых клетках недостаточно велик для того, чтобы самостоятельно (без натриевого тока) обеспечить регенеративный потенциал действия. Поэтому имеются мембраны, где именно кальциевые каналы обеспечивают входящий кальциевый ток, а передний фронт потенциала действия создает мощный натриевый ток, который обеспечивает деполяризацию мембрану. Эта деполяризация и активирует кальциевые каналы во многих клетках.

Процесс инактивации кальциевых каналов более сложный, чем натриевых каналов. У натриевых каналов происходит инактивация вследствие деполяризации мембраны, у кальциевых инактивация зависит от силы кальциевого тока. Чем выше ICa, тем быстрее инактивация, которая развивается в результате увеличения внутриклеточной концентрации ионов кальция [Ca2+]in. Если [Ca2+]in приблизительно достигает 10–7 - 10–6 М, то проводимость кальциевого канала обратимо подавлена.

Регуляция и модуляция активности кальциевых каналов может производиться многочисленными способами (факторами). На их активность могут влиять циклические нуклеотиды (цАМФ и цГМФ) и другие продукты метаболизма клетки.

Условно кальциевые каналы подразделяют на: медленные:

1.порог активации – 30мВ

2.двухфазная инактивация

3.блокирование производными 1,4-дигидропиридина

быстрые:

1.порог активации – 70 – 60 мВ

2.быстрая инактивация

3.отсутствие чувствительности к 1,4дигидропиридинам

Активный транспорт

Перенос иона в процессе активного транспорта осуществляется транспортными АТФ–фазами, энергозависимой лимитирующей стадией которого, является гидролиз АТФ. Так происходит первично-активный транспорта.

Если же перенос веществ обеспечивает энергия, обусловленная градиентом ионов, созданным в ходе первично-активного транспорта, то это

– вторично-активный транспорт. С его помощью осуществляется перенос сахаров и аминокислот за счет энергии, обусловленной градиентом ионов, чаще натрия, созданного первично – активным транспортом.

Функциональное значение активного транспорта определяется тем, что он осуществляет неравномерное распределение ионов между клеткой и средой – для большинства тканей концентрация внутриклеточного калия

86

больше, чем внеклеточного, а концентрация внутриклеточного натрия меньше, чем внеклеточного. Поддержание постоянного ионного состава клетки обеспечивает ионный гомеостаз, необходимый для осуществления жизненноважных градиентзатратных процессов.

Первично-активный транспорт отличает одновременное использование источника энергии – АТФ и транспорт ионов. Поэтому все ионные насосы (транспортные АТФ-азы) являются одновременно ферментами, гидролизующими АТФ – АТФ-азами.

Все транспортные АТФ-азы прокариотических и эукаритических клеток делятся на 3 типа: P-тип, V-тип, F-тип.

АТФ-азы P-типа являются примером осуществления обязательной стадии фосфорилирования и дефосфорилирования, сопряженной со структурными переходами белков, то есть образования ковалентного фосфорилированного промежуточного продукта (фосфомедиата).

К АТФ-зам цитоплазматической мембраны этого типа относятся:

Na,+K+– АТФ-аза
Ca2+–АТФ-аза	плазматическая мембрана эукариот.
H+– АТФ-аза

Внутриклеточные АТФ-зы P–типа:

Ca2+ – АТФ-аза эндо-(сарко) плазматического ретикулума эукариот.

К+ – АТФ-аза наружных мембран прокариот. Устроены довольно просто, действуют как насос.

Ранее АТФ-азы Р – типа назвали ферментами Е1/Е2 типа. Переименовали их потому, что есть АТФ-азы, не имеющие отношения к транспорту ионов, но они функционируют, находясь в Е1 и Е2 конформациях (ZB миозиновая АТФ-аза).

АТФ-азы V-типа находятся в мембранах в вакуолях дрожжей, в лизосомах, эндосомах, секреторных гранулах животных клеток (Н+–АТФ- азы). Они наименее изучены.

АТФ-азы F-типа находятся в мембранах бактерий, в хлоропластах, митохондриях. Образованы:

1.Водорастворимой частью – F1, которая состоит из нескольких субъединиц и обладает каталитической активностью.

2.Гидрофобная часть F0, участвующей в транслокации водорода. Особенностью АТФ-азы F-типа является способность производить

энергию АТФ в ответ на перенос протонов водорода.

Задачи по IV – VI разделам

1.Чему равен поток формамида через плазматическую мембрану Chara ceratophylla толщиной 8 нм, если коэффициент диффузии его составляет

87

1,4 10-8 см2 с-1, концентрация формамида в начальный момент времени снаружи была равна 2 10-4 М, а внутри в 10 раз меньше.

2.Бислойная липидная мембрана (БЛМ) толщиной 10 нм разделяет камеру на две части. Поток метиленового синего через БЛМ постоянен и равен 3 10-4 М см/с, причем концентрация его с одной стороны мембраны равна 10-3 М, а с другой – 2 10-3 М. Чему равен коэффициент диффузии этого вещества через БЛМ?

3.Определите коэффициент диффузии в воде эритрола, если среднее смещение его молекулы составляет 40 мкм.

4.Найдите коэффициент проницаемости плазматической мембраны Mycoplasma для формамида, если при разнице концентраций этого вещества внутри и снаружи мембраны, равной 0,5 10-4 М плотность потока его через мембрану равна 8 10-4 М см/с.

5.Толщину двойного слоя на границе мембрана-электролит характеризует

дебаевский радиус экранирования . Определите для случая, когда в растворе электролита, окружающем мембрану, есть только ионы калия в концентрации: 1) 10-5 М; 2) 10-2 М.

6.Найдите дебаевский радиус экранирования, создаваемого присутствующими в растворе ионами кальция с концентрацией 10-5 М и

натрия с концентрацией 10-4 М. Как изменится , если в растворе будут только ионы кальция в концентрации 10-4 М?

7.Какова связь электродиффузии и электрофореза? Проанализируйте связь, исходя из основного уравнения электродиффузии.

8.Потенциал покоя нервного волокна кальмара равен –60 мВ, а потенциал действия +35мВ. Вследствие чего происходит такое изменение мембранного потенциала?

9.Какое из соединений, приведенных ниже, имеет наименьшую проницаемость через липидный бислой и почему: толуол, этанол, ионы

кальция, калия? Приведите необходимые уравнения.

10.Определите равновесный мембранный потенциал митохондрий, если при 370С внутри митохондрий рН = 9, а в окружающей среде 7? Температура окружающей среды равна 200С.

Тест–задания

1.Пути проникновения веществ в клетку:

A.растворение в липидном бислое

B.разрыв связей между молекулами липидов

C.посредством специальных мембранных белков

2.Правила Овертона связывают проницаемость мембран для органических молекул

A.с их молекулярной массой

88

B.с их подвижностью в липидной фазе

C.с количеством полярных и неполярных группировок в молекуле

3.Полярные вещества проникают в клетку:

A.путем растворение в липидном бислое

B.путем разрыва связей между молекулами липидов

C.посредством специальных мембранных белков - пор

4.Энергетический фактор проницаемости связан:

A.С соотношением диаметра поры и кристаллического радиуса иона

B.С жесткостью стенок поры

C.С энергией гидратации иона

5.Соотношение энергии гидратации для одновалентных катионов:

A.Li > Na > K > Rb > Cs

B.Li < Na < K < Rb < Cs

C.Li = Na = K > Rb = Cs

6.Локусы с малой силой поля обеспечивают прохождение иона через пору:

A.В гидратированном виде

B.В дегидратированном виде

C.В виде соли

7.Локусы с большой силой поля обеспечивают прохождение иона через пору:

A.В гидратированном виде

B.В дегидратированном виде

C.В виде соли

8.Методы исследования проницаемости мембран:

A.Осмотический метод

B.Калориметрический метод

C.Индикаторный метод

D.Электронно - микроскопический метод

E.Радиоизотопный метод

F.Метод измерения электропроводности

9.Понятие транспорта включает:

A.Способность мембраны пропускать данное вещество

B.Способ проникновения вещества через мембрану

C.Кинетику проникновения вещества через мембрану

10.Транспорт, осуществляемый против градиента с затратой энергии макроэргов, называется:

A.Активный

B.Пассивный

C.Электрогенный

11.Активный от пассивного вида транспорта отличается:

A.направлением относительно градиента концентрации

B.использованием энергии

C.видом переносимых ионов

12.Перенос ион-транспортирующей системой двух ионов в противоположных направлениях называется:

A.Унипорт

B.Симпорт

89

C.Антипорт

13.Простая диффузия - это:

A.Процесс самопроизвольного проникновения вещества через мембрану по градиенту концентрации

B.Процесс самопроизвольного проникновения вещества через мембрану против градиента концентрации

C.Процесс проникновения вещества через мембрану по градиенту концентрации с участием белка - переносчика

14.Облегченная диффузия - это:

A.Процесс самопроизвольного проникновения вещества через мембрану по градиенту концентрации

B.Процесс самопроизвольного проникновения вещества через мембрану против градиента концентрации

C.Процесс проникновения вещества через мембрану по градиенту концентрации с участием белка - переносчика

15.Кинетика процесса диффузии вещества через клеточную мембрану описывается:

A.Уравнением Коллендера - Берлунда

B.Уравнением Фика

C.Уравнением Бернулли

16.Кинетика процесса облегченной диффузии описывается уравнением:

A.Фика

B.Коллендера - Берлунда

C.Михаэлиса - Ментен

17.Механизмы проникновения воды через клеточную мембрану:

A.Через поры, сформированные интегральными белками

B.Через структурные дефекты в мембране - кинки

C.Посредством растворения в липидном бислое

18.Осмос - это движение воды через мембрану:

A.В область меньшего гидростатического давления

B.В область меньшей концентрации растворенных веществ

C.В область большей концентрации растворенных веществ

19.Онкотическое давление - это:

A.Осмотическое давление внутри клетки

B.Компонент осмотического давления, обусловленный белками

C.Осмотическое давление в клетках злокачественной опухоли

20.Фильтрация - это движение воды через мембрану:

A.В область меньшего гидростатического давления

B.В область меньшей концентрации растворенных веществ

C.В область большей концентрации растворенных веществ

Правильные варианты ответов
1.	A, C	8.	A, C, E, F	15.	A
2.	C	9.	B	16.	C
3.	C	10.	A	17.	A, B
4.	C	11.	A, B	18.	C
5.	A	12.	C	19.	B
6.	A	13.	A	20.	A
7.	B	14.	C

90