microbio_zool

3

ПРЕДИСЛОВИЕ

Настоящее методическое пособие является дополнением к имеющимся руководствам и учебниками по микробиологии для студентов сельскохозяйственного факультета по специальности «Зооинженерия». В нем приводятся основные данные для практического усвоения студентами основ общей микробиологии, вирусологии и иммунологии.

Предложенные практические занятия используются в работе кафедры фармакологии и микробиологии медицинского факультета Петрозаводского государственного университета в течение многих лет. Они разработаны на основе учебной литературы по микробиологии и на материалах, излагаемых в лекциях.

Пособие включает тринадцать лабораторных занятий, изложенных в пяти разделах: «Морфология микроорганизмов», «Физиология микроорганизмов», «Санитарно-бактериологические исследования окружающей среды», «Инфекция и иммунитет», «Микрофлора кормов, молока и молочнокислых продуктов». Каждое занятие представлено в определенной последовательности: 1) тема, 2) цель занятия, 3) перечень оборудования, 4) вопросы для обсуждения, 5) вводная теоретическая часть, 6) ход работы, 7) тестовые задания для самоконтроля знаний, 8) ключевые слова.

В пособии приведены также таблицы, схемы, рисунки, которые должны облегчить студентам восприятие изучаемого материала. К контрольным тестовым заданиям прилагаются ответы, что дает студентам возможность использовать материал для самоконтроля и тренировки. Последнее необходимо для более прочного усвоения наиболее трудных положений, требующих неоднократного повторения и самоконтроля.

Методическое пособие рассчитано в основном на студентов сельскохозяйственного факультета, но отдельные методические указания по особенностям инфекционного процесса, иммунитета и механизмам серологических реакций могут быть использованы в учебном процессе и на биологическом факультете.

4

РАЗДЕЛ I. МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Занятие № 1

Тема: Правила работы в бактериологической лаборатории. Техника приготовления и простая окраска препаратов. Морфология микроорганизмов. Цель занятия: Ознакомиться с правилами работы в микробиологической лаборатории. Освоить правила работы с иммерсионным микроскопом. Ознакомиться с методами приготовления и окраски препаратов. Изучить основные формы бактерий.

Материалы и оборудование: Микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, дистиллированная вода, тушь, иммерсионное масло, фильтровальная бумага, набор красок фуксин основной и метиленовая синька.

Вопросы для обсуждения:

1.Формы и размеры бактерий.

2.Техника приготовления фиксированных препаратов. Простая окраска.

I.Правила работы в микробиологической лаборатории

1.Запрещается в помещении лаборатории:

-оставлять без присмотра спиртовки;

-держать вблизи спиртовок вату, марлю, спирт;

-убирать пролитые огнеопасные жидкости вблизи спиртовок;

-пробовать на вкус и вдыхать вещества;

-курить и есть;

-работать без спец.одежды;

-выполнять посторонние работы;

-касаться руками микробного материала,

-переливать жидкости с микробной культурой из одной емкости в другую.

2.Работать инструментами: петлей, иглой, пинцетом.

3.После работы необходимо пинцеты простерилизовать в пламени спир товки, а пипетки и шпателя поместить в дезинфицирующий раствор.

4.Нельзя руками касаться конденсата воды при посеве в чашки

5.При посеве необходимо делать надписи на пробирках, чашках: Ф.И.О., N группы, дата посева.

6.Нельзя оставлять на столе незафиксированные мазки, чашки Петри и другую посуду с материалом.

5

7.После работы необходимо вымыть руки с мылом и обработать их дезинфицирующим раствором; петли, пинцеты простерилизовать в пламени спиртовки, а пипетки и шпателя поместить в дезинфицирующий раствор.

8.Если случайно пролили культуру или разбили посуду с микробной культурой, необходимо о случившемся сообщить преподавателю.

II. Особенности работы с иммерсионным микроскопом

При изучении микроорганизмов используют иммерсионные объективы. Обязательным условием является погружение объектива в масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла (1.52). Используют кедровое, вазелиновое, персиковое и иммерсионное масло. Пучок света, вышедший за пределы предметного стекла, не рассеивается, и лучи, не меняя своего направления, попадают в объектив. При использовании иммерсионного объектива вначале центрируют оптическую часть микроскопа, поднимают конденсор до уровня предметного стекла, полностью открывают диафрагму, устанавливают объектив 8 и при помощи плоского зеркала освещают поле зрения.

На предметное стекло с окрашенными препаратами нанести каплю масла, под контролем глаза сбоку, иммерсионный объектив погрузить осторожно в масло, затем, наблюдая в окуляр, установить вначале макровинтом, а затем микровинтом четкое изображение препарата. Препарат изучают левым глазом, не закрывая правого. По окончании работы поднять тубус, снять препарат, салфеткой удалить масло с объектива и отвести его в сторону.

III. Техника приготовления мазков и окраски препаратов

Предметное стекло обезжиривают в пламени спиртовки. На стекло стерильной бактериологической петлей наносят исследуемый материал и равномерно распределяют на поверхности. При приготовлении мазков из плотных сред предварительно на предметное стекло помещают каплю дистиллированной воды, затем бактериологической петлей вносят в нее исследуемый материал и размазывают тонким слоем до получения мазка. Бактериологическую петлю до и после использования прокаливают на пламени спиртовки. Мазок высушивают при комнатной температуре и фиксируют. Цель фиксации: закрепить материал на стекле, обезвредить и сделать восприимчивым к красителям. Существуют физические и химические методы фиксации. В первом случае предметное стекло с мазком мед

6

ленно 3_ 4 раза проводят нижней поверхностью над пламенем спиртовки. При химическом методе препарат помещают на определенное время в химические вещества: метиловый спирт, этиловый спирт, ацетон и другие.

Окрашивание _ это физико-химический процесс, адсорбция краской микробной клетки. Для этих целей используют анилиновые красители _ основные, или нейтральные, которые взаимодействуют с кислым радика-

лом клетки СООН , и кислые, взаимодействующие с основным радикалом

NH2+. Различают простую и сложную окраску препарата. При простой окраске используют один краситель. Дифференциальный способ предусматривает использование разных красителей для изучения структуры бактериальной клетки.

Ход работы:

I. Приготовить препарат из культуры бактерий, выросшей на плотной питательной среде (из колонии).

Зафиксировать препарат, окрасить простым методом: фуксином или метиленовой синькой;

Промикроскопировать с иммерсией, зарисовать.

II.Окрасить зубной налет с помощью негативной окраски по Бурри.

Предметное стекло обезжирить и нанести на него каплю дистиллированной воды и каплю туши;

Стерильной бактериологической петлей внести микробную культуру (небольшой кусочек зубного налета, взятого у шейки зуба) в каплю с дистиллированной водой и равномерно смешать с тушью. Второе предметное стекло поместить на первое под углом 45о и после равномерного распределения капли, движением справа налево приготовить тонкий мазок;

Препарат высушить, рассмотреть под микроскопом с иммерсией, зарисовать все выявленные формы бактерий зубного налета.

Негативный способ окраски позволяет исследовать микроорганизмы в

неокрашенном виде. При этом способе прокрашивается фон препарата тушью, а бактерии не воспринимают краситель. При микроскопировании таких препаратов на окрашенном темном фоне четко выделяются неокрашенные тела микробов в виде ярко освещенных телец.

III.Результаты исследований оформить в протокол.

7

Тесты для проверки знаний:

1.Стрептококки располагаются:

а) одиночно, б) парами, в) цепочкой, г) пакетами.

Ответ: в

2.Определить правильную последовательность приготовления препарата: 1) зафиксировать, 2) в каплю воды внести микроорганизмы, 3) на стекло поместить каплю воды, 4) приготовить мазок, 5) высушить.

Ответ: 3, 2, 4, 5, 1

Ключевые слова: основные красители, кислые красители, простой препарат, сложный препарат, фиксация.

Занятие № 2

Тема: Структура бактериальной клетки. Сложные методы окраски.

Цель занятия: Освоить: метод окраски бактерий по Граму, выявление зерен волютина по Нейссеру, окраску капсул у бактерий по Бурри-Гинсу, окраску спор по Пешкову.

Материалы и оборудование: Микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, дистиллированная вода, растворы красок, этиловый спирт 96%, пробирки с микробными культурами, иммерсионное масло, фильтровальная бумага.

Вопросы для обсуждения:

1.Строение микробной клетки.

2.Клеточная стенка Гр (+) и Гр (-) бактерий. Механизм и теория окраски по Граму.

3.Структура цитоплазмы, включений. Природа гранул волютина и методы окраски.

4.Клеточная стенка, капсула бактерий. Значение, методы выявления.

5.Споры и спорообразование у бактерий. Принцип окраски спор у бактерий.

6.Строение жгутика, пили. Типы движения микробов.

7.Особенности эукариотических клеток.

8

I.Состав и функции поверхностных структур бактериальной клетки

Структура	Функции	Химический состав
1	2	3
Клеточная стенка Гр(+)	Механическая защита,	Пептидогликан	(40-90%),
бактерий	жесткость формы,	тейхоевые кислоты,	белки
однослойная	проницаемость
Клеточная стенка	Механическая защита,	Пептидогликан	(5-10%),
Гр(-) бактерий	жесткость формы,	липополисахариды,	липиды,
многослойная	проницаемость	белки
Капсулы	Защитная от фагоцитоза,	Полисахариды, полипептиды,
	во внешней среде от	мукополисахариды
	высыхания
Цитоплазматическая	Проницаемость, биосинтез,	Полисахариды, белки, липи-
мембрана + мезосомы	перенос электронов, при-	ды
	крепление и разделение
	ДНК
Жгутики	Движение	Белок (флагеллин)
Секс-пили	Конъюгационный канал	Белки (пилины)
Пили общего	Адгезия	Пилин
назначения

II. Механизм и теория окраски по Граму

Сущность метода окраски по Граму связана с тем, что у грамположительных микроорганизмов генцианвиолет в присутствии йода образует в протоплазме комплекс йодпарарозамин, который не растворяется в спирте и ацетоне благодаря наличию магниевой соли. Такие бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Клетки грамотрицательных видов этим свойством не обладают, и спирт обесцвечивает их, а при последующем докрашивании фуксином они приобретают красный цвет. К грамположительным бактериям относят: клостридии, бациллы, коринебактерии, коринеформные формы бактерий, микобактерии, стафилококки, стрептококки, лактобациллы; все патогенные кокки, за исключением менингококка и гонококка. В группу грамотрицательных бактерий входят: нейссерии, энтеробактерии, вибрионы, псевдоманады, спириллы, риккетсии, спирохеты.

9

III. Зерна волютина

Волютин, или метахроматические гранулы один из типов включений, резерв фосфата и источник потенциальной клеточной энергии. Непо-

стоянно присутствует у Azotobacter, Spirillum volutans, Bac.subtilis в клет-

ках дрожжей и некоторых патогенных бактерий – возбудителей сибирской язвы и дифтерии. Метахроматическим свойством обязан наличию полифосфата. Полифосфаты представляют собой линейные полимеры ортофосфата с различной длиной цепи. Недостаток любого из питательных веществ приводит к образованию волютина. Недостаток сульфата сказывается особенно эффективно, вызывая быстрое накопление полифосфата. Когда клетки, создавая запас полифосфата, снова снабжаются сульфатом, полифосфат исчезает и включается в нуклеиновые кислоты.

Образование полифосфата происходит путем последовательного присоединения остатков фосфата к пирофосфату при участии АТФ:

Ф Ф + АТФ Ф Ф Ф + АДФ

При окрашивании зерна запасных питательных веществ адсорбируют иные красители, нежели протоплазма, и поэтому окрашиваются в другие цвета.

IV. Капсулы бактерий

Клетки многих микроорганизмов в процессе роста их на средах, богатых углеводами, могут быть окружены рыхлым слизистым слоем капсулой, состоящей из полисахаридов, полипептидов, мукополисахаридов и т.д. Капсулы несут защитную функцию от фагоцитоза и антител, а во внешней среде – от высыхания. Капсульное вещество обладает выраженными протективными свойствами и обязательно включается в состав вакцин. Анатомически различают: а) микрокапсулу толщиной 200 нм не выявляется с помощью оптического микроскопа, различается химическими и серологическими способами; в) макрокапсулу 200 нм цитологически хорошо видна в световой микроскоп; с) слизистый слой, состоящий из экстрацеллюлярных веществ, временно удерживаемых на поверхности бактерий.

По строению различают капсулы следующих типов: 1) нормального строения, окружающая равномерным слоем клеточную стенку, 2) содержащая поперечно-полосатые фибриллы из экстрацеллюлярных нитей цел

10

люлозы, 3) сложная капсула, состоящая из локализованных участков полисахаридов и полипептида, 4) прерывистая капсула.

Уклебсиелл капсулы постоянны во внешней среде и в макроорганизме.

Уостальных паразитических бактерий (пневмококк, сибирская язва) капсулы образуются только во внутренней среде хозяина.

Вещества капсулы слабо фиксируют краситель, который легко отмывается. Выявить капсулы можно с помощью метода “негативного контрастирования” с использованием жидкой туши.

V. Споры бактерий

Образование спор у бактерий рассматривается как один из этапов в жизненном цикле клетки, связанный с переживанием неблагоприятных условий среды. К спорообразованию способны только бациллярные формы. В период образования спор в бактериальной клетке наблюдается высокий уровень обменных процессов. В районе проспориальной зоны накапливаются нуклеиновые кислоты, запасные белки, липиды, углеводы, соли магния и кальция. Появляется дипиколиновая кислота, которая в соединении с солями кальция придает споре высокую термостойкость. Зрелая спора представлена цитоплазмой с тяжами ядерного вещества. Цитоплазма покрыта цитоплазматической мембраной и многослойной оболочкой: внутренней интиной, средней кортексом, и наружной экзиной. Некоторые виды бактерий на поверхности имеют экзоспориум.

У бактерий выделяют три типа спорообразования: бациллярный спора занимает центральное положение в клетке; клостридиальный спора располагается эксцентрально и плектридиальный спора формируется полярно.

Методы окраски спор основаны на применении протрав обычно слабых кислот, разрыхляющих оболочки споры, и дальнейшей окраске мазка сильным красителем при нагревании. Окрасившийся протопласт споры обладает высокой кислотоустойчивостью по сравнению с протопластом вегетативной клетки. Он не обесцвечивается при дифференциации мазка в кислоте и сохраняет воспринятую им окраску. Вегетативные клетки бактерий полностью отмываются в кислоте и на препарате имеют цвет дополнительного красителя.

11

Ход работы:

I.Приготовить препарат из зубного налета и окрасить по Граму.

На фиксированный мазок положить бумажку Синева, смоченную дистиллированной водой;

Через 2 минуты бумажку снять и на мазок добавить каплю раствора Люголя на 1 2 минуты;

После этого раствор Люголя слить и мазок поместить в стакан с 96% этиловым спиртом на 25 30 секунд;

Затем препарат тщательно промыть водой и на мазок налить раствор фуксина Пфейфера на 2 минуты;

Краску смыть водой и препарат высушить фильтровальной бумагой. II. Приготовить препарат из культуры Saccharomycces carevisae (пробирка

№ 1) и окрасить по Нейссеру.

Приготовить тонкий мазок клеток, высушить его на воздухе и зафиксировать в пламени спиртовки;

На фиксированный мазок налить уксуснокислый метиленовый синий и окрасить клетки Saccharomycces carevisae в течение 1 минуты;

Краситель слить, препарат промыть водой, добавить раствор Люголя на 20 30 секунд и окрасить хризоидином 10 15 минут;

После промыть водой, высушить и микроскопировать с иммерсионной системой. При этом клетки окрашиваются в желтый цвет, а зерна волютина – в сине-черный.

Промикроскопировать и зарисовать.

III.Приготовить препарат из культуры азотобактера (пробирка № 2).

На конец предметного стекла бактериологической петлей нанести каплю черной туши, внести в нее клетки азотобактера, хорошо перемешать и ребром покровного стекла сделать мазок;

Препарат высушить на воздухе и зафиксировать на 5 10 минут смесью Никифирова или на 3 минуты 97%-ным спиртом;

Далее мазок окрасить карболовым фуксином Циля, разбавленным водой в соотношении 1:3. Время окрашивания 2 3 минуты;

Препарат промыть водой, высушить на воздухе и микроскопировать с иммерсионной системой. На темно-сером фоне препарата контрастно выделяются розово-малиновые клетки бактерий, окруженные бесцветными капсулами.

Промикроскопировать и зарисовать.

12

IV. Приготовить препарат из культуры "СТИ" (пробирка № 3), окрасить по Пешкову.

На обезжиренное предметное стекло бактериологической петлей внести культуру "СТИ" (штамм Bacillus anthracis anthracis);

Приготовить мазок, высушить его на воздухе, зафиксировать в пламени спиртовки и залить раствором метиленового синего по Леффлеру;

Краситель довести до кипения, держа предметное стекло над пламенем спиртовки. Продолжительность окраски с момента закипания 10 20 секунд;

Затем предметное стекло охладить, препарат тщательно промыть водой, после чего клетки в течение 30 секунд докрасить 0.5%-ным водным раствором нейтрального красного;

Краситель слить, препарат промыть водой и просмотреть с иммерсионной системой. При правильном окрашивании клетки имеют красный, а споры синий цвет.

Промикроскопировать и зарисовать, отметив наличие спор. V. Оформить протокол исследования.

Тесты для проверки знаний:

I. Установить соответствие структуры клеточной стенки:

1.Гр (+)	а) содержит тейхоевые кислоты;
2.Гр (-)	б) есть наружная мембрана;
	в) пептидогликана 5-10 %;
	г) содержит ЛПС;
	д) пептидогликан многослойный.
	Ответ: 1. а, д
	2. б, в, г

2. Определить правильную последовательность окраски зерен волютина по Нейссеру: 1) раствор Люголя; 2) промыть водой; 3) уксусно-кислая синька; 4) хризоидин.

Ответ: 3, 1, 2, 4, 2

Ключевые слова: клеточная стенка, пептидогликан, тейхоевые кислоты, капсула, споры, жгутики, пили, включения, волютин, мезосомы.