Электрофорез в агарозном геле

9

Экспериментальная часть

Предостережение: бромистый этидий является сильным мутагеном/канцерогеном и умеренно токсичен. Необходимо всегда надевать перчатки для работы с растворами и гелями, содержащими бромистый этидий

Оборудование

•прибор для горизонтального электрофореза и источник тока

•микроволновая печь или мешалка с нагревом

•микропипетки

•реакционные пробирки на 1.5 мл

•весы для взвешивания навесок в 0.1 г

•шпатели

•штатив для реакционных пробирок

•стеклянная посуда

•ультрафиолетовый трансиллюминатор (длина волны 312 нм)

•приборы для документирования результатов (например, фотоаппарат – Полароид или видеокамера)

Реактивы

•агароза, пригодная для электрофореза ДНК

•	Tris [оксиметил] аминометан (Tris)	CAS 77-68-1
•	борная кислота
•	Na2 EDTA	CAS 6381-92-6
•	бромистый этидий	CAS 1239-45-8
•	сахароза
•	ксиленцианол FF	CAS 2650-17-1

•ДНК маркеры

•ДНК фага лямбда, расщепленная EcoRI/HindIII(или другой подходящий маркер)

•набор фрагментов ДНК известной длины с шагом 100 н.п.

Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов

Сессия 5

Электрофорез в агарозном геле

10

10х ТВЕ буфер (1 литр)
Tris [оксиметил]аминометан (Tris)	54.0 г
Борная кислота	27.5 г
Na2 EDTA	7.44 г

•Смешать реагенты с ионизованной водой до получения 1 л раствора при рН 8.3

•Хранить при комнатной температуре

6х буфер для нанесения (10 мл)
ксиленцианол FF	0.025 г
Сахароза	4 г

•Добавить сахарозу и ксиленцианол FF в деионизованную воду до получения 10 мл раствора.

•Перемешать раствор, автоклавировать и хранить при 4 ° С.

Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов

Сессия 5

Электрофорез в агарозном геле

11

Процедура электрофореза

•Заклейте края чистых, сухих пластиковых подложек для геля либо клейкой лентой, либо другим способом. Вставьте соответствующую гребенку, так чтобы образовались лунки при добавлении агарозного раствора.

•Разведите 10х ТВЕ буфер для приготовления соответствующего количества 0.5х ТВЕ буфера, для заполнения электрофоретической камеры и приготовления геля

• Взвесьте сухую агарозу в соответствие с Таблицей 2 и добавьте ее к соответствующему количеству 0.5х ТВЕ буфера в колбу Эрленмейера со свободно закрывающейся крышкой (обычно требуется 150 мл гелевого раствора для подложек для геля, размером 15 х 15 см, и 100 мл геля для подложек для геля, размером 15 х 10 см).

Таблица 2. Концентрации агарозного геля, используемые на Курсах

	ГМО 3 ГМО 4	Зеин 3 Зеин 4	P35S–cf3 P35S–cr3	HA-nos118-f HA-nos118-r	CRYIA3 CRYIA4	ГМO 7 ГМO 8	mg3 mg4	Геномная ДНК
0.8-1%								х
1.5%	х	х
2.0%			х	х	х	х	х

•Нагрейте взвесь агарозы в микроволновой печи или на бане с кипящей водой до

•растворения агарозы (проверьте объем раствора после нагревания)

•Охладите смесь до 50 - 60° С, добавьте бромистый этидий (базовый раствор с концентрацией 10 мг/мл) до конечной концентрации 0.2 мкг/мл и тщательно перемешайте

•Залейте раствор на подложку для геля, и дайте гелю застыть. Количество использованного геля должно соответствовать образованию слоя толщиной около

3-5 мм.

•После того как гель полностью сформируется, аккуратно удалите гребенку и ленту, и поместите гель в электрофоретическую камеру

•Добавьте достаточное количество 0.5х ТВЕ буфера в прибор для электрофореза, чтобы гель был покрыт слоем буфера около 2 – 5 мм.

Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов

Сессия 5

Электрофорез в агарозном геле

12

Приготовьте образцы и маркеры для геномной ДНК как указано далее:

Исследуемый образец		Маркер
вода	3 мкл	вода	6 мкл
буфер для нанесения	2 мкл	буфер для нанесения	2 мкл
образец	5 мкл	λ ДНК EcoRI / Hind III	2 мкл
	10 мкл		10 мкл

Приготовьте образцы и маркеры для продуктов ПЦР как указано далее

Исследуемый образец		Маркер
буфер для нанесения	2 мкл	набор фрагментов ДНК	15 мкл
образец	8 мкл	известной длины с шагом
		100 н.п

10мкл

•Нанесите 10 мкл каждого образца в последовательно расположенные лунки, а соответствующие ДНК маркеры в первую и последнюю лунки

•Закройте крышку электрофоретической камеры и подсоедините электропровода таким образом, чтобы ДНК перемещалась в сторону анода, подайте напряжение 5

–10 V/см

•Продолжайте электрофорез до того момента, когда ксиленцианол пройдет надлежайшее расстояние в геле ( ~ 40 – 60 минут)

•Отключите ток, отсоедините провода и крышку электрофоретической камеры. Поместите гель на фильтр УФ трансиллюминатора и сфотографируйте гель

•Использованный гель поместите в специальный контейнер для твердых отходов, содержащих бромистый этидий

Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов

Сессия 5