Краткая общая схема иммунного ответа и кооперативного взаимодействия макрофагов, т- и в – лимфоцитов.

1. Антиген поглощается макрофагом.

2. Макрофаг осуществляет процессинг антигена и

3. Представляет процессированный антиген на своей поверхности Т- и В - лимфоцитам.

4. Т -хелпер узнает антиген и, в свою очередь, активируется (синтезирует факторы роста и дифференцировки для В-лимфоцитов.)

5. В-лимфоцит также распознает и несет процессированный анти­ген и активируется, в. том числе и сигналами Т-хелпера.

6. Активированные В-лимфоциты пролиферируют и дифференцируются в антителообразующие клетки и клетки памяти (активированные Т-лимфоциты также дают клон клеток памяти - из одной клетки образуется около 1000 клеток клона памяти).

7. Антитела связываются с антигеном, маркируют его таким образом для узнавания другими компонентами иммунной системы, включая системы комплемента и макрофагов, которые и уничтожают микробную клетку.

8. Особенность противовирусного иммунитета: Т-киллеры убивают клетку хозяина, инфицированную вирусом, и уничтожают ее вместе с вирусом.

Распознаванию вирусных антигенов в инфицированной клетке способствуют антигены MHC класса I.

Главная система гистосовместимости (Major Histocompatability Complex - MHC) у человека - система HLA - антигенов (Human Leucocyte Antigen System), с нею связаны следующие функции:

1) Интенсивное отторжение аллотрансплантатов ткани.

2) Стимуляция образования антител.

3) Стимуляция реакции в смешанной культуре лимфоцитов (бласттрансформации).

4) Реакция "трансплантат против хозяина".

5) Клеточная реакция лимфолиза.

6) Контроль силы иммунного ответа (гены Immune response - Ir ).

7) Рестрикция (ограничение) иммунного ответа.

8) Контроль синтеза некоторых компонентов системы комплемента.

Система МНС у человека (НLA) включает 7 генетических локусов. Основные среди них - локусы А,В,С.

Локус

1.HLA -А

2.HLA -В Контролируют синтез антигенов МНС класса I (основные

3.НLA -С трансплантационные антигены)

4.HLA -DR

5.HLA –DQ Контролируют синтез антигенов МНС классаII(Iа - антигены)

6.HLA –DP

7-й локус, отвечающий за синтез некоторых факторов системы компле­мента (С2,С4,В) - антигены МНС класса III (встречаются только в сыворотке).

Кроме того, с системой HLA сцеплен локус Ir, контролирующий силу иммунного ответа.

Структура антигенов МНС

Антигены класса I состоят из двух цепей:

а) тяжелая цепь - гликопротеин, м.м. 45 кДа, выступает над мембраной;

б) легкая цепь - β - микроглобулин, м.м. 11.6 кДа, закодирован вне МНС.

Антигены МНС класса I имеют почти все клетки, но с разной степенью экспрессии. Играют важную роль в трансплантационном иммунитете, а также в распознавании Т-киллерами клеток, зараженных вирусом. Антигены класса II (Iа - антигены) также состоят из двух цепей:

α- цепь - гликопротеин, м.м. 35 кДв

β - цепь - гликопротеин, м.м. 25 кДа

Антигены МНС класса II имеют макрофаги, Т- и В-лимфоциты, клетки Лангерганса, дендритные клетки и, возможно, другие.

Значение антигенов класса П.

Т- хелперы и Т-супрессоры распознают чужеродные антигены в ассоциации с антигенами класса П, которые находятся на поверхности клеток, вовлеченных в иммунный ответ (Т- и В-лимфоциты, макрофаги и др.).

Таким образом, белки МНС класса IIиграют важную роль в повы­шении эффективности иммунного ответа.

Классификация и свойства интерферонов

В организме существует три антигенно различных типа молекул интерферона: α-,β-и γ-интерфероны, которые различаются по физико-химическим свойствам, биологии действия и оказывают разнообразное влияние на многочисленные функции клеток и тканей. Существует два вида рецепторов для различных интерферонов: один для α- и β-интер­феронов (рецепторы I-го типа), другой - для γ -интерферона (рецеп­торыII-го типа).

Интерферон - альфа (IFN-α) - лейкоцитарный, стабилен при рН 2,0; взаимодействует с рецепторами 1-го типа.

Интерферон-бета (IFN- β) - фибробластный, стабилен при рН 2,0; взаимодействует с рецепторами 1-го типа.

Интерферон-гамма (IFN-γ ) - иммунный (лимфоцитарный), нестабилен при рН 2,0; взаимодействует с рецепторами II-го типа.

Основные свойства интерферонов:

противовирусное, иммуномодулирующее, противоопухолевое, противобактериальное (бактерицидное и бактериостатическое).

З А Н Я Т И Е 17

Дата ______________

Тема: Серологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Современные иммунологические реакции: реакция иммунофлюоресценции (РИФ), иммуно-ферментный анализ (ИФА), иммуноблотинг (ИБ), радиоиммунный анализ (РИА).

План занятия:

1. Регистрация результатов опыта по определению титра агглютинирующей сыворотки.

2. Иммунофлуоресцентный метод. Получение диагностических люминесцирующих сывороток и их применение:

а) прямой иммунофлуоресцентный метод;

б) непрямой иммунофлуоресцентный метод.

3. Применение методов иммуносорбентного анализа твердой фазы:

а) применение иммуноферментного метода (ИФМ);

б) применение радиоиммунного метода (РИМ).

4. Моноклональные антитела и их применение.

Методические указания

1.Учесть окончательный результат реакции агглютинации и определить титр испытуемой агглютинирующей сыворотки. Результаты опыта отметить в таблице, схема которой дана ниже.

Результаты реакции агглютинации учитываются следующим образом:

++++ полная агглютинация, жидкость прозрачная, хорошо выраженный осадок;

+++ жидкость слегка опалесцирует, но осадок хорошо выраженный;

++ жидкость непрозрачная, выраженный осадок;

+ сомнительная реакция;

— отрицательная реакция, взвесь равномерно мутная, осадок отсутствует.

Титром агглютинирующей сыворотки следует считать максимальное разведение ее, при котором еще произошла реакция агглютинации в степени не менее, чем в два плюса.

Результаты реакции агглютинации

	Разведения сыворотки
	Контроль	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600
Степень агглютинации

Вывод____________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.а) Прямой иммунофлуоресцентный метод.

Приготовить на предметном стекле из исследуемой культуры бактерий тонкий мазок (в густом мазке не удается отметить свечение отдельных клеток). Границы мазка отметить с тыльной стороны восковым карандашом. Подсушить препарат на воздухе и погрузить его в стакан­чик с 96° этиловым спиртом для фиксирования на 15 минут, а затем вновь подсушить на воздухе. После этого нанести на мазок каплю люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении. (Рабочее разведение сухих люминесцирующих сывороток указано на этикетке ампулы). Препарат обрабатывается сывороткой в течение 15-20 минут при комнатной температуре. По окончании окраски каплю сыворотки стряхивают, а препарат промывают в течение 10 минут проточной водопроводной во­дой, затем подсушивают на воздухе и наносят на него каплю разведенного глицерина (9 частей глицерина +1 часть физиологического раст­вора). Накрывают препарат покровным стеклом, избыток жидкости уда­ляют фильтровальной бумагой.

Микроскопию производят в люминесцентном микроскопе. При этом используют специальное нефлуоресцирующее иммерсионное масло.

При наличии в исследуемом материале бактерий, по отношению к которым люминесцирующая сыворотка содержит антитела, на темном фоне препарата обнаруживается специфическое яркое желто-зеленое свечение по периферии бактериальных клеток. Посторонние бактерии не светятся.

Для оценки интенсивности специфического свечения используют четырехкрестовую систему:

++++ сверкающая флуоресценция желтовато-зеленого цвета с четко выраженной формой клеток;

+++ яркая флуоресценция желто-зеленого цвета;

++ и + заметная, но слабо выраженная флуоресценция.

Положительным результатом считается флуоресценция, оценивае­мая

на ++++ и +++.

Иммунофлуоресцентный метод является методом ускоренной ориентировочной диагностики и должен сопровождаться полным бактериологическим исследованием.

б) Непрямой иммунофлуоресцентный метод предусматривает использование единой флуоресцирующей сыворотки - антиглобулиновой, содержащей антитела против кроличьих глобулинов. Как правило, диагностические специфические сыворотки являются кроличьими, поэтому флуоресцирующая антиглобулиновая сыворотка реагирует с любыми специфическими антителами (кроличьими глобулинами), которые при этом играют роль антигенов. Кроличьи глобулины (специфические антитела) связываются с гомологичными антигенами. На образовавшихся комплексах фиксируются флуоресцирующие антиглобулиновые антитела и вызывают их свечение в люминесцентном микроскопе.

3.В основе методов иммуносорбентного анализа твердой фазы лежит сорбция антител (для обнаружения неизвестного антигена) или антигена (для обнаружения соответствующих антител) и специфических антител, меченных ферментом (ИФМ) или изотопом (РИМ). Чувствительность этих методов значительно превышает чувствительность обычных иммунологических реакций, поэтому они приобрели самое широкое рас­пространение. Практически эти методы могут быть использованы для диагностики любого инфекционного заболевания. С помощью этих методов можно определять как антигены, так и антитела к ним. Методика постановки этих реакций включает три последовательных этапа.

Обнаружение антигена с помощью ИФМ и РИМ.

Первый этап- адсорбция специфических антител твердой фазой, в качестве которой обычно используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых микротитраторных панелей. Антитела нековалентно связываются со стенками лунок, но у них сох­раняются свободными активные центры, и они способны поэтому специ­фически реагировать с соответствующим антигеном.

Второй этап- связывание антигена из суспензии исследуемого материала за счет реакции антитело-антиген, происходящей на границе твердая фаза - жидкость. После этого луночки промывают раствором, содержащим слабый неионный детергент, для удаления из системы других, неспецифически связанных с антителами компонентов.

Третий этап- обработка твердой фазы с фиксированными на ней комплексами антитело - антиген специфическими антителами против дан­ного антигена, но меченными либо ферментом, либо изотопом. Такие меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется из системы промыванием. Таким образом, в случае присутствия в иссле­дуемом материале искомого антигена на поверхности твердой фазы формируется комплекс: антитело-антиген - меченое антитело. Результаты реакции учитывают в зависимости от характера метки. Для иммуноферментного метода антитела метят ферментом, чаще всего пероксидазой или щелочной фосфатазой. Субстратом для пероксидазы служит ортофенилендиамин (ОФД) в смеси с Н₂0₂, используемый в виде раствора в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0). Добавление в опытную луночку раствора ОФД приводит к тому, что он подвергается действию персокидазы, фиксированной на антителах, образующиеся продукты реакции имеют желтую окраску, интенсивность которой позволяет количественно оценивать результаты опыта фотометрированием.

Радиоиммуный метод (РИМ) предусматривает использование антител, меченных изотопом, поэтому результаты реакции оценивают путем определения радиоактивности исследуемых образцов. При положительной реакции уровень радиоактивности опытных образцов более чем в 2 раза превышает уровень радиоактивности контрольных, заведомо отрицатель­ных образцов.

Обнаружение специфических антител с помощью ИФМ и РИМ

Для обнаружения антител эти реакции также ставятся в три этапа.

Первый этап- адсорбция специфических антигенов на стенках луночек. Обычно планшеты в коммерческих тест-системах уже имеют сенсибилизированные луночки, т.е. на их стенках антигены уже адсорбированы.

Второй этап- добавление в луночки образцов исследуемой сыворотки для обнаружения в них специфических антител к данному анти­гену. Если они имеются, то вступают во взаимодействие с антигеном и образуют комплекс антиген-антитело.

Третий этап- после отмывания луночек в них добавляют специфические антиглобулиновые антитела (антивидовые, т.е. антитела про­тив человеческих иммуноглобулинов, но меченные ферментом (ИФМ) либо изотопом (РИМ). Результаты реакции оцениваются как указано выше. В качестве контролей используют образцы, заведомо положительные и заведомо отрицательные.

4.Моноклональные антитела - антитела, продуцируемые одним клоном антителообразующих клеток. По всем параметрам антитела, вырабатываемые одним клоном, идентичны (по классу иммуноглобулинов; по их типу и антительной специфичности). Они взаимодействуют только с одним антигеном, и это обстоятельство значительно повышает специфичность всех иммунологических реакций, в которых они участвуют. Получение моноклональных антител стало возможным после того, как в 1975 году Кёллером и Мильштейном была разработана методика получения клеточных гибридов -гибридом путем слияния нормальных лимфоцитов иммунизированных животных с культивируемыми в питательной среде клетками миеломных штаммов. Были использованы такие штаммы, которые не содержали фермента гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы (поэтому они погибают в селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин - ГАТ).

Лимфоциты в такой среде не гибнут. Слияние лимфоцитов с миеломными клетками осуществляется с помощью полиэтиленгликоля. Слившиеся гибридомные клетки получают от лимфоцита способность синтезировать определенные антитела (моноклональные антитела, т.е. анти­тела одной специфичности) и способность выживания в среде с ГАТ. От миеломного партнера они получают способность размножаться бесконеч­но in vitro.

Накопившийся гибридомный клон может быть размножен, а синтези­руемые им моноклональные антитела могут быть получены в неограниченном количестве.

Уже созданы фирмы по выработке моноклональных антител любой специфичности в качестве уникальных реагентов, диагностических и лечебных препаратов.

Получение лимфоцитарных гибридом включает в себя несколько эта­пов:

1. Получение миеломкой линии.

2. Получение селезеночных клеток от иммунизированного организма.

3. Создание в культуре условий для того, чтобы хотя бы некоторые клетки одной и другой популяции могли осуществить слияние.

4. Выделение слившихся клеток и накопление их клонов.

5. Отбор заданного клона, его накопление и использование. Накопление клона осуществляется in vitro или путем введения животным.

При этом на всех этапах образующиеся клетки необходимо консер­вировать в жидком азоте, чтобы в любое время можно было вернуться к любому этапу и сохранить на будущее нужные клоны.

В качестве миеломных клеток чаще всего используются мышиные или крысиные клеточные линии. Гибридомы создают не только на основе В - лимфоцитов, обеспечивающих возникновение культур, синтезирующих моноклональные антитела, но и на основе Т - лимфоцитов. Уже сконструированы культуры Т - гибридом, синтезирующие лимфокины.

Контрольные вопросы

На чем основаны методы иммуносорбентного анализа твердой фазы?

С какой целью используются иммуноферментные методы?

Каким образом с помощью ИФМ можно обнаружить антитела в иссле­дуемой сыворотке?

Каким образом с помощью ИФМ можно обнаружить антиген в иссле­дуемом материале?

Как ставится реакция латекс-агглютинации и как она оценивается?

Что такое моноклональные антитела и каковы их преимущества перед обычными иммунными сыворотками?

Как получают моноклональные антитела?

Из каких основных этапов складывается постановка реакций иммуноферментного метода и радиоиммунного метода?

Что такое гибридомы и как их получают? Какие клетки скрещивают­ся для получения гибридом?

Какая разница между антигенным и антительным эритроцитарным диагноетикумом?

Каковы преимущества и недостатки иммунофлуоресцентного метода?

Почему препараты-мазки при этом методе исследования не должны быть слишком густые?

В чем состоит сущность иммунофлуоресцентного метода исследования?

Каково различие между прямым и непрямым методами иммунофлуоресцентного исследования?

З А Н Я Т И Е 18

Дата ______________

Тема: Итоговое контрольное занятие «Инфекция и иммунитет».