Результаты реакции агглютинации

	Контроль	Разведения сыворотки
		1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200
Степень агглютинации

Вывод_________________________________________________________________________________________________________________________________________________

7.Развернутая (пробирочная) реакция агглютинации ставится или с сывороткой больного (для определения в ней титра антител) или с диагностической сывороткой (для изучения антигенной структуры выделенного возбудителя). В том и другом случае дяя постановки опыта необходимы:

а) сыворотка больного в разведении 1:25 или диагностическая сы­ воротка в исходном разведении (или в сухом виде, тогда она разводится в отношении 1:25 или 1:50);

б) диагностикум - взвесь соответствующих известных убитых бак­терий в I мл I млрд микробных тел (для серологической диагностики) или взвесь исследуемых бактерий (для определения их антигенной структуры);в) физиологический раствор;

г) пипетки объемом I мл и 5 мл;

д) штатив с набором агглютинационных пробирок.

8.В настоящее время для диагностики многих заболеваний широко используется реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Она основана на способности эритроцитов адсорбировать на своей поверхности специфические микробные антигены или антитела к ним. Сенсибилизированные таким образом эритроциты агглютинируются в присутствии гомологичных антител или антигенов. Для постановки реакции пассивной гемагглютинации необходимо иметь:

1. Сенсибилизированные эритроциты, или эритроцитарный диагностикум (т.е. эритроциты, на которых адсорбированы антигены возбудителя) или эритроцитарный антительный диагностикум (т.е. эритроциты, на которых адсорбированы антитела к микробным антигенам). Метод сенсибилизации эритроцитов зависит от вида возбудителя или природы антител.

2. Исследуемую сыворотку (сыворотку больного или бактерионоси­теля, в которой определяют наличие антител к возбудителю) или дру­гой материал от больного, в котором предполагается наличие возбудителя или его антигенов.

3. Физиологический раствор.

4. Соответствующие контрольные системы (заведомо положительные и заведомо отрицательные) для большей, специфичности диагноза.

Для постановки РПГА используют либо круглодонные агглютинационные пробирки одинакового диаметра либо специальные полистироло­вые пластинки с луночками.

Постановка опыта

Во все пробирки (луночки) разливают физиологический раст­вор: в 1-ю пробирку -0,9 мл, а в остальные - по 0,5 мл. Затем в 1-ю пробирку вносят 0,1 мл испытуемой сыворотки, перемешивают и пе­реносят 0,5 мл во 2-ю, вновь перемешивают и переносят из 2-й пробирки в 3-ю 0,5 мл и так далее до 7-й пробирки включительно. Из 7-й пробирки 0,5 мл жидкости выливают, 8-я пробирка служит контро­лем и поэтому сыворотки не содержит.

Эритроцитарный диагностикум перед использованием встряхивают до полного исчезновения осадка на дне и получения гомогенной взвеси. По ходу работы встряхивание часто повторяют. Эритроцитарный диагностикум разливают во все пробирки по 0,5 мл. после этого пробирки встряхивают и помещают на 1,5-2 часа в термостат при 37 °С, а затем учитывают результаты реакции (иногда через 16-20 часов).

Учет реакции производят по четырехкрестной схеме:

++++ полная гемагглютинация, эритроциты равномерно устилают почти все дно пробирки, нередко в виде зонтика;

+++ почти все эритроциты агглютинированы и равномерно покры­вают дно пробирки;

++ наряду с равномерным агглютинатом на дне пробирки имеется осадок в виде маленького колечка или "пуговки";

+ большинство эритроцитов осело в центре дна пробирки в виде диска и лишь незначительное количество агглютинировалось с образованием мелких хлопьев;

—признаков агглютинации нет: эритроциты осели в виде маленького колечка или "пуговки" (диска) в центре дна пробирки.

Титром испытуемой сыворотки считается последное ее разведение, которое дает ярко выраженную агглютинацию эритроцитов, не менее чем на +++.

Вариантами использования РПГА являются реакция нейтрализации антигена (рНАг), реакция нейтрализации антител (рНАт), реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). Для этих реакций используются антигенные и антительные эритроцитарные диагностикумы. Можно использовать одновременно две взаймоконтролирующие однонаправленные реакции, например РПГА с антигенным диагностикумом и рНАг с антительным эритроцитарным диагностикумом.

Реакция нейтрализации антител (рНАт) заключается в том, что суспензию, содержащую искомый антиген, смешивают со специфической иммуннойсывороткой, содержащей известные антитела, в соответствующих объемах и инкубируют при 37 °С в течение двух часов. После этого добавляют антигенный эритроцитарный диагностикум. Смесь встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Результаты учитывают через 3-4 часа и окончательно через 18-24 часа. Если в исследуемом материале имеется антиген, то он свяжет антитела (нейтрализует их) и поэтому гемагглютинации не произойдет.

По такому же принципу ставится реакция нейтрализации антигена (рНАг). Только в этом случае в исследуемом материале содержатся искомые антитела. Специфический антиген, добавленный к такому исследуемому материалу будет связываться с антителами, содержащимися в нем, т.е. произойдет нейтрализация антигена антителами и гемагглютинации при добавлении антительного эритроцитарного диагностикума не произойдет.

9.Одним из вариантов пассивной, т.е. опосредованной клетками-носителями антител, реакции агглютинации является коагглютинация. В основу этой реакции положено уникальное свойство стафилококков, имеющих в составе своей клеточной стенки белок А, связывать молекулы иммуноглобулинов классов Ig G и Ig M. Поскольку белок А взаимодействует с рецептором, который располагается на Fc - фрагменте молекулы антитела, его активные центры остаются свободными и могут взаимодействовать со специфическими детерминантами антигена.

Методика реакции.

На предметное стекло наносится капля 2% взвеси стафилококков, сенсибилизированных соответствующими антителами, добавляют каплю взвеси исследуемых бактерий, тщательно перемешивают. Результаты учитывают в течение 30-60 сек. и оценивают по 3-х крестной системе. При соответствии антигена антителам происходит четкая агглютинация нагруженных антителами стафилококков. Для контроля каплю взвеси стафилококков добавляют в каплю физиологического раствора. В контроле агглютинации не должно быть.

б) Реакция латекс-агглютинации (ЛАГ) также является чувствительным и специфическим методом диагностики. Основным условием успешной постановки ЛАГ является строгое соблюдение количественных соотношений компонентов системы при постановке реакции, выполняемой микрометодом, в лунках на стекле: к 50 мкл исследуемого материала добавляют 10 мкл латекс-препарата, частички которого несут на себе специфические антитела. После перемешивания смесь в течение 10 мин встряхивают. Результаты учитывают по 4-х крестной системе. Положительной считают реакцию, оцененную не менее чем двумя крестами. Всего на постановку реакции и ее учет тратится-около 30-40 мин. Специфичность ЛАГ оценивается с помощью трех контрольных тестов, содержащихся в коммерческих тест-системах (заведомо положительная реакция, заведомо отрицательная, контроль качества латекс-суспензии по ЛАГ несенсибилизированных, т.е. не несущих антител, латексов с исследуемым материалом. Все ингредиенты ЛАГ, включая контроля, входят в состав тест-системы. В качестве носителей специфических антител в нашей стране используются: полистироловые монодисперсные латексы с разными диаметрами частиц (0,3; 0,8; 0,66; 0,75 мкм).

в) Реакция агрегат-гемагглютинации (РАГА) позволяет быстро обнаружить в крови больного как свободно циркулирующие антигены (антигенемия), так и антигены, связанные с антителами (циркулирующие иммунные комплексы - ЦИК). Для РАГА используют эритроциты, сенсибилизированные соответствующими антителами. Добавление сыворотки больного, в которой содержатся антигены, к сенсибилизированным эритроцитам, на которых фиксированы антитела, приводит к склеиванию (агглютинации) эритроцитов и антигенных комплексов.

10.Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:

а) преципитирующую сыворотку;

б) антиген в виде прозрачного раствора (экстракт из микробных тел, из органов или из других патологических субстратов);

в) физиологический раствор;

г) набор специальных преципитационных пробирок.

Порядок работы

В преципитационную пробирку наливают 0,5 мл преципитирующей сыворотки, затем при помощи пастеровской пипетки наслаивают на сыворотку 0,5 мл раствора антигена. Пробирку при этом следует держать в наклонном положении, а после добавления антигена пробирку ставят в штатив (в вертикальном положении). При положительной реакции на границе двух жидкостей появляется тонкое кольцо помутнения. Степень реакции оценивается по выраженности кольца и времени его появления. Обычно кольцо появляется в течение первых 3-10 минут.

Приготовление бактериального гаптена

Суточная культура бактерий на пластинках МПА в чашках Петри смывается 4-5 мл 1%-ной уксусной кислоты. Смыв кипятят на водяной бане 30-60 минут, фильтруют через асбестовую вату, фильтрат нейтрализуют 20 %-ным раствором углекислого натрия в присутствии индикатора. Полученный гаптен в количестве 0,5 мл наслаивают на равный объем преципитирующей сыворотки, цельной или разведенной вдвое. На границе между сывороткой и гаптеном появляется кольцо преципитата.

11.Реакция преципитации в агаре.

Реакция преципитации в агаре является одним из наиболее чувст­вительных методов анализа растворимых антигенов. Она позволяет выявить число индивидуальных антигенов в исследуемой жидкости (например, в бактериальных или тканевых экстрактах) и произвести анализ антигенного родства отдельных компонентов в смеси антигенов.

Для постановки реакции используют I %-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе. Тщательно профильтрованный полностью прозрачный расплавленный агар разливают в чашки Петри слоем 0,5 см толщиной. После застывания в пластинке агара с помощью металлической трубочки вырезаются луночки диаметром 5-6 мм - одна в центре чашки и 4-5 по окружности на расстоянии 2 см от центральной. В цент­ральную луночку наливается сыворотка кролика, иммунизированного исследуемым антигеном, а в периферические - раствор исследуемого антигена и сравниваемых с ним веществ. Чашки помещаются в эксикатор с налитой на дно водой (для предупреждения высыхания) при комнатной температуре. Учет результатов реакции производится через 24, 48 и 72 часа.

Антитела из центральной луночки и антигены из периферических диффундируют, навстречу друг другу, и в участках, где создаются эквивалентные концентрации антител и антигенов, выпадает дугообразная полоса преципитации. Появление нескольких полос преципитации между центральной и периферическими луночками указывает на наличие нескольких антигенных компонентов в исследуемой жидкости. Если полосы преципитации, идущие от двух соседних луночек, сливаются, это ука­зывает на идентичность антигенов, содержащихся в этих луночках. Взаимное пересечение полос преципитации свидетельствует о серологи­ческой неидентичности антигенов.

Реакция кольцепреципитации: 1 – опыт 2 – контроль

Реакция преципитации в агаре

12.Реакция лизиса.

а) Реакция гемагглютинации. На чистое стекло наносят пастеровс­кой пипеткой каплю гемолитической сыворотки (инактивированной в отношении комплемента), рядом - другой пипеткой - каплю физиологического раствора. Затем в обе капли добавляют по I капле 4 %-ной взвеси эритроцитов барана (не касаться пипеткой капли сыворотки). С помощью бактериальной петли перемешивают добавленные эритроциты сначала с физиологическим раствором, а затем с сывороткой (но не наоборот!). Реакция склеивания эритроцитов (гемагглютинация) происходит только в опытной капле. Она наступает быстрее при легком покачивании стекла и осторожном подогревании. В контрольной капле склеивания эритроцитов не происходит (так как там отсутствуют антитела);

б) реакция гемолиза. На чистое стекло наносят на расстоянии 1,5 см друг от друга две капли гемолитической сыворотки в разведении 1:300. На таком же расстоянии от второй капли наносят другой пипеткой каплю физиологического раствора. Во все три капли чистой пасте­ровской пипеткой добавляют по I капле 4%-ной взвеси отмытых бара­ньих эритроцитов. После этого в первую и третью капли добавляют по I капле комплемента (свежая сыворотка морской свинки) в разведении 1:10, а во вторую каплю вместо комплемента добавляют физиологичес­кий раствор в том же объеме. После этого содержимое всех капель тщательно перемешивают (перед каждым перемешиванием петля должна быть прокалена и остужена). Для ускорения наступления реакции стек­ла могут быть слегка подогреты высоко над пламенем спиртовки или в термостате 10 минут. Реакция гемолиза происходит только в первой капле, в которой содержатся все необходимые для этого ингредиенты: эритроциты, антитела (сыворотка) и комплемент. Во второй капле про­изойдет реакция агглютинации, так как в ней имеются антиген (эрит­роциты) и антитела (сыворотка), но нет комплемента. В третьей капле (эритроциты + комплемент; никаких видимых изменений не произойдет.

Результат РПГА

	Контроль	Разведения сыворотки
		1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:1640	1:1280
Степень агглютинации

Вывод_________________________________________________________________________________________________________________________________________________

13.Реакция связывания комплемента. Разбор методики постановки РСК, определения рабочих доз антигена, комплемента, получения гемолитической сыворотки. Для постановки основного опыта РСК необходимы следующие ингредиенты:

а) антиген, рабочая доза которого уже оттитрована;

б) исследуемая сыворотка;

в) комплемент, рабочая доза которого должна быть также оттит­рована:

г) гемолитическая сыворотка с известным титром;

д) 3 %-ная взвесь отмытых эритроцитов барана;

е) физиологический раствор.

Антиген для реакции связывания комплемента готовится из соответствующих микроорганизмов (бактерий, вирусов) или может быть неспецифическим (в реакции Вассермана – кардиолипиновый антиген). В связи с тем, что антиген может обладать антикомплементарным действием, перед постановкой опыта он титруется, т.е. устанавливается его рабочая доза. Титром антигена считается такая доза последнего, которая не вызывает задержки гемолиза. Для работы берут дозу антигена, равную половине его титра.

Источником комплемента для РСК служит свежая (или высушенная) сыворотка крови морской свинки. Титром комплемента называется его минимальное количество, которое в присутствии рабочей дозы гемолитической сыворотки обеспечивает полное растворение эритроцитов. Для постановки основного опыта берут дозу комплемента, увеличенную на 20-25% по сравнению с установленным титром.

Гемолитическую сыворотку получают иммунизацией кролика эритроцитами барана. Титром гемолитической сыворотки называется то макси­мальное разведение ее; которое, будучи смешано с равным объемом (0,5 мл) 10%-ного раствора комплемента, полностью гемолизирует 0,5 мл взвеси эритроцитов в течение 1 часа при 37 °С . В основной опыт бе­рется сыворотка, разведенная до 1/3 своего титра. Так, если титр сы­воротки 1:1200, то в опыт берется сыворотка в разведении 1:400.

Исследуемая сыворотка (т.е. сыворотка больного) перед опытом инактивируется при 56 °С в течение 30 минут, чтобы исключить действие имеющегося в ней комплемента. В реакцию следует брать сыворотку в разведении 1:5.

Все ингредиенты для РСК берут в дозе по 0,5 мл. Недостающее количество компонентов доводят до указанного объема физиологическим раствором. Титрование ингредиентов производят накануне постановки реакции.

Схема постановки основного опыта РСК

Ингредиенты	Номера пробирок
	1	2	3
Испытуемая сыворотка	0,5	0,5	—
Антиген	0,5	—	0,5
Физиологический раствор	—	0,5	0,5
Комплемент	0,5	0,5	0,5
В термостат при 37 °С на 1 час
Гемолитическая сыворотка	0,5	0,5	0,5
Эритроциты барана	0,5	0,5	0,5
В термостат при 37 °С на 30-60 минут

Результаты РСК учитывают дважды: после инкубации в термостате и на следующий день (через 18-20 часов). Интенсивность реакции оценивают по 4-баллъной системе:

++++ полная задержка гемолиза: жидкость над эритроцитами не окрашена, эритроциты в осадке;

+++ неполная задержка гемолиза: жидкость над эритроцитами слабо-розового цвета, значительный осадок эритроцитов;

++ частичная задержка гемолиза: жидкость красная, осадок эритроцитов;

+ слабая задержка гемолиза, жидкость интенсивно-красная, незначительный осадок эритроцитов;

± следы задержки гемолиза: гемолиз почти полный, при взбалтывании со дня поднимается незначительный осадок в виде облачка;

— полный гемолиз: лаковая кровь, осадок отсутствует.