Результаты посева на среды Плоскирева, Эндо, мпа

Микроорганизм	Количество колоний или степень интенсивности роста на средах
	Плоскирева		Эндо	МПА
Кишечная палочка
Фекальный щелочеобразователь
Стафилококк
МПА		Среда Эндо
1. Escherichia coli; 2. Alcaligenes faecalis; 3. Staphylococcus

3. Вопросы к итоговому контролю по теме «Морфология и физиология бактерий».

1. Строение бактериальной клетки.

2. Спора бактерий, строение, назначение, отличия от спор грибов.

3. Основные компоненты белоксинтезирующей системы бактерий.

4. Принцип фазовоконтрастной микроскопии.

5. Принцип темнопольной микроскопии.

6. Основные отличия между прокариотами и эукариотами.

7. Основные типы культур бактерий.

8. Признаки, применяемые для идентификации микроорганизмов.

9. Определения всех методов микробиологической диагностики.

10. Структура жгутика бактерий.

11. Классификация бактерий по количеству и взаиморасположению жгутиков.

12. Методы определения подвижности бактерий.

13. Структура пептидогликана.

14. Принцип окраски бактерий по Граму, отличия клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

15. В каких случаях употребляются термины «бактерии», «бациллы», «клостридии»?

16. Что такое L-формы бактерий, в каких случаях они возникают?

17. Методы выявления спор у бактерий.

18. Что такое нумерическая таксономия?

19. Что такое конститутивные, индуцибельные, репрессибельные ферменты?

20. Отличия между ядерным аппаратом прокариот и эукариот.

21. Структура и функции цитоплазматической мембраны.

22. Функции клеточной стенки бактерий.

23. Что такое мини-клетки, когда они образуются?

24. Типы дыхания бактерий, сущность и разница.

25. Строение и функции липополисахарида клеточной стенки.

26. Что такое «вид» микроорганизма?

27. Что такое архебактерии?

28. Классификация бактерий по морфологии и взаиморасположению.

29. Механизм деления бактерий. Время жизни клетки (формула).

30. Механизмы поступления питательных веществ в бактериальную клетку.

31. Активный транспорт веществ у бактерий.

32. Классификации питательных сред, требования к ним.

33. Что такое плазмиды?

34. Что такое микроаэрофилы?

35. Причины чувствительности анаэробов к молекулярному кислороду воздуха.

36. Состав среды Китта-Тароцци.

37. Состав и химизм работы среды Вильсон-Блера.

38. Что такое волютин, как его выявляют и у каких бактерий?

39. Этапы выделения чистой культуры возбудителя.

40. Как изучают протеолитические свойства бактерий?

41. Как изучают сахаролитические свойства бактерий?

42. Методы культивирования анаэробов.

43. Определение подвижности бактерий по Пешкову.

44. Как у бактерий определяют способность выделять индол?

45. Как у бактерий определяют способность выделять сероводород?

46. Состав среды Эндо, как на ней растут разные кишечные бактерии?

47. Как изучают развернутые биохимические свойства бактерий?

48. Какой состав имеют МПА и МПБ?

49. Как судят о чистоте выделенной культуры микроорганизма?

50. Актиномицеты, морфология, друза.

51. Плесневые (нитчатые) грибы, родовые морфологические отличия.

52. Микроскопическая дифференциальная диагностика малярии.

53. Назвать патогенных простейших из класса Flagellata.

54. Морфология трипаносом, какие заболевания они вызывают?

55. Морфологические отличия дрожжей и дрожжеподобных грибов Candida.

56. Морфология токсоплазмы, ее роль в патологии человека.

57. Диагностика амебиаза, морфология и жизненный цикл возбудителя.

58. Морфологические отличия возбудителя вивакс и тропической малярии.

59. Чем отличается лейшманиальная форма лейшмании от лептомонадной?

60. Патогенные спирохеты, морфология и классификация.

61. Что такое стерилизация и дезинфекция?

62. Методы стерилизации.

63. Методы контроля качества стерилизации.

З А Н Я Т И Е 7

Дата ______________

Тема: Бактериофагия. Генетика микроорганизмов. Мутации и рекомбинации.

План занятия:

1. Явление бактериофагии. Демонстрация феномена бактериофагии на жидких и плотных средах.

2. Методы титрования фага.

3. Типы и механизмы генетических рекомбинаций: трансформация, трансдукция, конъюгация (разбор схем).

а) Опыт трансдукции (разбор)

б) Постановка опыта конъюгации.

2.Плазмиды бактерий. Классы и свойства R-плазмиды.

3.Молекулярные механизмы мутаций у бактерий (разбор).

4.Получение рекомбинантных молекул ДНК (разбор).

Методические указания

1.Зарисовать феномен бактериофагии на плотной питательной среде.

2.Для титрования бактериофага используются различные методы. Наиболее точным является метод агаровых слоев, предложенный Грациа. Сущность этого метода состоит в следующем.1,5%-ный МПА с генцианвиолетом (0,1 мл 0,1% генционвиолета на 1 л среды), который добавляется для предохранения от загрязнения грамположительной воздушной микрофлорой, накануне опыта разли­вают по 25-30 мл в чашки Петри. Чашки хорошо просушивают в термостате или под бактерицидной лампой, после чего оставляют на ночь при комнатной температуре.

Перед опытом 0,7% МПА расплавляют и разливают по 2,5 мл в пробирки, охлаждают до 46-47^°С и затем добавляют в пробирки по 1 мл исследуемого фага (предварительно разведенного) и 0,1 мл эталонной культуры, все это быстро и тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями, после чего выливают в чашки на поверх­ность 1,5% агара. Смесь осторожными движениями распределяют так, чтобы над слоем 1,5% агара образовался слои 0,7% агара, содержащего бактериофаг и чувствительную к нему культуру бактерий. Для застывания добавленного агара чашки оставляют на столе на 1-1,5 часа, а затем помещают в термостат при 37^°С. Для получения четких результатов необходимо соблюдение следующих условий: а) чашки с 1,5% агаром должны быть хорошо высушены; б) чашки должны находиться после добавления 0,7% агара строго в горизонтальном положении во избежание стекания агара в одну сторону; в) расплавленный 0,7% агар после охлаждения до 46°С нельзя долго хранить, так как он может приобрести гелеобразную консистенцию.

Учет результатов титрования можно производить после 5-6-часо­вого инкубирования в термостате. Для этого подсчитывают количество колоний фага («стерильных» пятен) и умножают полученное число на фактор разведения. На­пример, при посеве 1 мл фага, разведенного в 10^-7на чашке обнаружено 45 колоний, следовательно, титр фага равен 45×10⁷= 4,5×10⁸Зарисовать демонстрационный опыт титрования фага по Грациа.

Бактериофагия на плотной ПС («стерильные» пятна)	Титрование фага по методу агаровых слоёв (по Грациа)

3.а) Опыт трансдукции.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиента Е. соli1ас^-добавляют в таком же количестве трансдуцирующий фаг, выделенный из культурыЕ. соli1ас⁺, в концентрации 10⁶-10⁷. Смесь инкубируют при 37^°С в течение часа, после чего 0,1 мл высевают на среду Эндо. В качестве контроля на среду Эндо высевают также культуру Е.соli lас⁺(реципиент без фага). Посевы ставят на сутки в термостат. Учет результатов производят по числу выросших окрашенных колоний.

б) Опыт конъюгации.

Сущность опыта заключается в том, что от донорных клеток путем конъюгации передаются гены, контролирующие способность синтезировать треонин и лейцин, клеткам-реципиентам, ауксотрофным по этим аминокислотам.

В качестве донора используется культура Е. coliHfr с генотипом tre⁺, lei⁺, met^-, str^s(str^s – чувствительность к стрептомицину). Реципиентом служит культураЕ. coliF^– с генотипом tre^-, lei^-, met⁺, str^r(str^r- устойчивость к стрептомицину) .

Для выделения рекомбинантов используют солевую среду М-9 со стрептомицином, содержащую глюкозы 1,0 г; стрептомицина – 200 ед/мл; NH₄Cl – 1,0 г; NaС1 – 0,5 г; Na₂HРO₄– 6,0 г; КH₂PO₄ – 3,0 г; Mg₂SO₄ – 0,2 г; дистиллированной воды – 1,0 л. Для тех же целей может быть испо­льзована плотная среда. В этом случае к указанному составу добавля­ется 20,0 г агар-агара.

На этой среде могут расти только рекомбинанты (трансконъюганты). Культуры донорного и реципиентного штаммов не растут на данной среде, так как первая ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а вторая ауксотрофна по треонину и лейцину.

Постановка опыта: к 2 мл 3-часовой бульонной культуры реципиен­та добавляют 1 мл 3-часовой бульонной культуры донора. Смесь инкубируют в течение 30 минут при 37°С. Затем смесь разводят в 100 и 1000 раз и засевают разведения в объеме 0,1 мл на селективную среду для выделения рекомбинантов. В качестве контроля на такую же среду засевают культуры донора и реципиента в том же объеме. На следующие сутки регистрируют результаты опыта. В пробирках с посевом рекомбинанта наблюдается помутнение среды. В средах с посевами донорной и реципиентной культур роста нет. Аналогичным образом регистрируют результаты посевов на плотных средах.

Просмотреть посевы культур донора, реципиента и рекомбинантов на минимальной среде со стрептомицином. Обратить внимание на рост культуры рекомбинантов. Культуры донора и реципиента не растут на данной среде, так как культура донора ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а культура реципиента ауксотрофна по треонину и лейцину.

Контрольные вопросы

Что такое бактериофаг?

Каковы морфология, размеры и химический состав фагов?

Что содержится в головке бактериофага?

Как устроен хвостик фага и каково его назначение?

Из каких этапов складывается взаимодействие фага с микробной клеткой?

Каким образом фаг вводит свою нуклеиновую кислоту в микробную клетку?

Как осуществляется синтез фаговых частиц внутри микробной клетки?

Какая разница между вирулентным и умеренным фагом?

Что такое лизогения и лизогенная конверсия?

Как выделяют фаги из объектов внешней среды?

Какова методика определения титра фага по Грациа?

Что такое фаготипирование? С какой целью оно применяется?

Что такое ген?

Что таков мутации спонтанные и индуцированные?

Каков молекулярный механизм мутации?

Какие вы знаете мутагены?

Что такое ауксотрофы? Как получают ауксотрофные штаммы бактерий?

Каков механизм генетических рекомбинаций?

Что такое трансформация?

Что такое трансдукция и какими свойствами обладает трансдуцирующий фаг?

Что такое конъюгация бактерий? Как она осуществляется?

Как производят картирование хромосом?

Что такое плазмида?

Какие известны классы плазмид?

Каковы основные свойства плазмид?

Какие существуют типы генетического контроля лекарственной устойчивости у бактерий?

Каковы основные функций F-фактора?

В чем заключается механизм конъюгации бактерий?

Что такое бактериоцины?

Каковы основные свойства Соl -плазмид?

Какими свойствами обладают R-плазмиды?

Как определяют конъюгативные свойства плазмид?

Как получают рекомбинантные молекулы ДНК?

Что такое генетический вектор?

Как у бактерий можно обнаружить плазмиды?

В каких направлениях могут быть использованы достижения генной инженерии?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 7.

Определение понятия ген

Ген– универсальная организующая структурная единица живой материи, которая благодаря содержащейся в ней закодированной информа­ции обеспечивает единство и многообразие всех форм существования жизни, ее непрерывность и эволюцию.

Ген – основной носитель и хранитель жизни, а его продукт – бе­лок – способ её существования.

Основные формы обмена генетическим материалом у бактерий

1.Конъюгация- обмен хромосомными и плазмидными генами путем установления контакта между донорной и реципиентной клетками с помощью донорных ворсинок (пилей). Механизм конъюгации контролируется конъюгативными (донорными) плазмидами.

2.Трансдукция- перенос генов от донорной клетки в реципиентную с помощью фагов.

3.Сексдукция- перенос генов от донорной клетки в реципиентную с помощью F-фактора (полового фактора).

4.Трансформация- поглощение компетентными клетками внеклеточной ДНК.

5.Трансфекция- поглощение протопластами свободной фаговой ДНК.

Плазмиды – наипростейшие живые существа, лишенные белковой оболочки и представленные только совокупностью организованных генов, определяющих их специфические свойства, наследственность, а также дополнительные признаки, которыми они наделяют клеткуносителя.

Плазмиды подразделяются на конъюгативные, т,е. способные к са­мопереносу, и неконъюгативные, перенос которых осуществляется конъюгативными плазмидами.

Передача плазмид среди бактерий происходит как по вертикали, так и по горизонтали, обеспечивая их эпидемическое распространение.

Специфические функции плазмид

1.Саморепликация.

2.Конъюгативность, или способность к самопереносу (у конъюгативных плазмид).

3.Мобилизуемость, или способность к мобилизации на перенос конъюгативными плазмидами (у неконъюгативных плазмид).

4.Контроль явления несовместимости.

5.Контроль явления поверхностного исключения.

6.Контроль числа копий на хромосому клетки-хозяина.

7.Контроль стабильности поддержания и распределения между дочерними клетками.

8.Способность наделять клетку-хозяина дополнительными важны­ми селективными свойствами. Фенотипические проявления этих свойств определяют класс плазмид.

Классы плазмид

КЛАСС	ФУНКЦИЯ
F-плазмиды	Донорные функции
R-плазмиды	Устойчивость к лекарственным препаратам
Col-плазмиды	Синтез колицинов
Ent-плазмиды	Синтез энтеротоксинов и факторов адгезии
Hly-плазмиды	Синтез гемолизинов
Биодеградативные	Разрушение различных органических соединений
Криптические	Функции неизвестны

Схема строения крупного Т-чётного фага

З А Н Я Т И Е 8

Дата ______________

Тема: Морфология и ультраструктура вирусов. Клеточные культуры. Репродукция вирусов. Методы индикации вирусов.

План занятия:

1. Вирусы: а) вирионы вируса оспы в препаратах, окрашенных по Морозову; б) внутриклеточные включения при бешенстве – микроскопия телец Негри.

2. Методы культивирования вирусов. Заражение материалом, содержащим вирусы, лабораторных животных.

3. Культивирование вирусов в культурах клеток. Получение первично-трипсинизированных клеток. Питательные среды и солевые растворы.

4. Подсчет количества клеток.

5. Культуры перевиваемых клеток. Микроскопия незараженных культур клеток.

6. Рассев клеток перевиваемых штаммов по пробиркам.

7. Заражение культуры клеток вирусом осповакцины (или каким-либо другим вирусом).

8. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах: а) изучение методов заражения куриных эмбрионов; б) заражение куриных эмбрионов вирусом гриппа.

Методические указания

1.а) Элементарные тельца (вирионы) вируса оспы (тельца Пашена) в препаратах, окрашенных по Морозову, выглядят в виде мелких точек круглой или удлиненной формы, темно-коричневого цвета.

б) Внутриклеточные включения при бешенстве (тельца Бабеша-Негри – выкристаллизовавшиеся нуклеокапсиды вируса) обнаруживаются в нервных клетках аммонова рога и в клетках Пуркинье мозжечка. В препарате, окрашенном по Туревичу, цитоплазма и ядра нервных клеток окрашенны в желто-зеленый (защитный) цвет. Тельца Негри расположены в цитоплазме рядом с ядром клетки и окрашены в ма­линово-красный цвет. При окраске по Манну - тельца Негри красного цвета на голубом фоне цитоплазмы.

Все рассмотренные препараты зарисовать.

Вирионы оспы (тельца Пашена) окраска по Морозову	Тельца Бабеша-Негри при бешенстве окраска по________________

2.Методы заражения животных разнообразны: внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, интраназальный, заражение в мозг и другие.

Заражение в мозг (метод применяют при работе с нейротропными вирусами). Для заражения чаще используют белых мышей. Левой рукой плотно прижимают мышь к столу, большим и указательным пальцами оттягивают кожу головы назад. Туберкулиновым шприцем с предохранительной муфтой на игле прокалывают лобную кость несколько латеральнее средней линии и вводят 0,02-0,03 мл материала. Игла вводится на глубину 1,5-2 мм, при этом отчетливо ощущается "провал" в полость черепа.

При заражении новорожденных мышей (2-3-дневного возраста) их лучше брать руками в перчатках, чтобы после заражения мышата не имели постороннего запаха (пота, дезинфицирующих веществ, антибиотиков и т.д.), так как самка съедает мышат, имеющих посторонний запах. Материал вводят в количестве 0,01 мл. Вытекающую жидкость удаляют сухим стерильным ватным тампоном без дезинфицирующих ве­ществ. После заражения мышат помещают в отдельную банку (в свое гнездо), а через 20-30 мин подсаживают к ним самку.

Больных мышат самка также съедает. Поэтому надо уловить момент извлечения зараженных животных для завершения опыта. Первые два дня просматривают мышат 1-2 раза в день, а затем чаще. Через 3-4 дня здоровый мышонок в два раза больше зараженного.

3.Кроме животных для культивирования вирусов используют куриные эмбрионы и культуры клеток различных тканей. Культуры ткани - это клетки ткани выращенные вне организма на специальной питательной. среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен и восприимчивость к определенным вирусам. Для культивирования вирусов особенно пригодны клетки с быстрым ростом. По этой причине широко применяют эмбриональные ткани (фибробласты куриных эмбрионов, клетки человека и др., а также культуры тканей опухолей (клетки Неla, Нер-2 и др.).

Кулътивирование клеток может производиться в специальных флаконах (колбы-матрацы, флаконы Карреля) и в пробирках. Культура клеток для роста должна иметь какую-либо опору, например, стенку пробирки.

В выросшую культуру ткани, которая покрывает стенку сосуда в виде однослойного клеточного пласта, засевают материал, содержащий вирус. Работу производят в стерильных условиях. Для подавления роста микрофлоры вируссодержащий материал предварительно обрабатывают антибиотиками, чаще пенициллином и стрептомицином.

О наличии и размножения вируса в клетках узнают по так называемому цитопатическому эффекту: в результате размножения вируса клетки гибнут, и под микроскопом заметны дегенеративные изменения клеток. Пласты зараженных клеток отслаиваются от стенки пробирки или флакона. Так как рост клеток прекращается, pН среды мало изменяется по сравнению с контролем (клетки без вируса).

Питательной средой для культуры ткани могут быть различные растворы, состав которых приближается к составу жидкости организма (синтетическая среда 199, солевой раствор Хенкса с сывороткой, гидролизат лактальбумина с сывороткой и другие).

Получение первично-трипсинизированных клеток.

Живые клетки для однослойных культур ткани могут быть получены из эмбрионов и органов взрослых животных (напр., из почек) и человека. Для диспергирования ткани используют 0,25-0,3% раствор трипсина, который разрушает межклеточные мостики из соединительной ткани и освобождает клетки.

Метод трипсинизации тканей состоит в следующем: ткань измельчают ножницами (или другим способом) на мелкие кусочки размером 1-3 мм, промывают в буферном растворе Хенкса для удаления крови 2-3 раза, до тех пор, пока жидкость не станет почти прозрачной. Для диспергирования отмытые кусочки ткани обрабатывают раствором трипсина (добавляют 2 объема раствора трипсина) при температуре 32-37°С. Трипсинизацию проводят в течение нескольких минут (до 10 мин) при постоянном перемешивании пипеткой или в смесителе на электромагнитной мешалке. Суспензию клеток собирают в сосуд, помещенный на лед для прекращения действия фермента. К оставшейся ткани добавляют свежие порции трипсина, т.е. процесс повторяют 6-8 раз, иногда и более – до прекращения помутнения раствора трипсина.

Жидкость, содержащую клетки, фильтруют через марлю для отделения от неё комочков ткани и соединительнотканных волокон, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 минут, надосадочную жидкость сливают, а клетки отмывают раствором Хенкса. Отмытые клетки добавляют к питательной среде (гидролизат лактальбумина с сывороткой, или среда 199 , или др.) в разведении 1:200.

4.С помощью камеры Горяева подсчитают количество клеток в 1 мл. Клетки считают по всей камере под малым увеличением микроскопа. Количество клеток в 1 мл вычисляют по формуле:

Количество клеток в 1 мл = ;

где а - количество клеток в камере;

3600 - количество квадратов в камере;

1/4000 мм - объем одного квадрата.

Так как в одном мл 1000 мм , то полученный результат умножают на 1000. После первого разведения (1:200) концентрация клеток дос­тигает 600000-1300000 на 1 мл. Клетки куриных эмбрионов разводят той же средой до концентрации 400000 клеток в 1 мл.

Взвесь клеток разливают по 1 мл в пробирки, которые плотно закрывают стерильными резиновыми пробками для того, чтобы среда не выщелачивалась. Пробирки помещают в термостат при 37^°С почти в горизонтальном положении (под углом в 5^°) в специальных штативах. Через 3-4 дня при микроскопии виден сплошной слой размножившихся клеток. Пробирки с хорошим ростом ткани отбирают для заражения вирусом.

5.В настоящее время имеется много стабильных штаммов клеток, пассируемых вне организма в течение многих лет. Эти культуры клеток называют перевиваемыми культурами ткани, или растущими культурами ткани. К ним относятся штаммы клеток, полученные из злокачественных опухолей и из нормальных тканей человека и животных: 1) штамм клеток Неla – клетки карциномы шейки матки человека; 2) штамм клеток Нер-2 – клетки злокачественной опухоли гортани человека; 3) штамм клеток Детройт-6 – клетки, выделенные из костного мозга человека, больного раком легких; 4) штаммы клеток А-0 и А-1 – клетки амниона человека; 5) штамм клеток ЕRК-клетки почек эмбриона кролика; 6)штамм клеток СОЦ - клетки сердца обезьяныMacacus cyn omolgusи многие другие. Эти штаммы клеток применяются только для диагностики вирусных заболеваний. Они не могут быть использованы для изготовления вакцинных вирусных препаратов, так как культуры клеток, полученные даже из нормальных тканей, в процессе длительных пересевов приобретают характер злокачественного роста.

Посмотреть под микроскопом демонстрационные препараты культур ткани и зарисовать.

Фибробласты куриных эмбрионов окраска по Романовскому	Клетки амниона человека окраска по Романовскому

6.Для поддержания роста клеток пересев делают через 6-7 дней. Количество клеток за это время увеличивается в 4-10 раз. При пересеве для отслаивания клеток от стекла используют 0,02% раствор Версена (двунатриевая соль этилендиаминотетраацетата –Na₂ЭДТА). При добавлении его к культуре клеток он связывает кальций и магний, благодаря которым клетки прикреплены к стеклу, и клетки отслаиваются от стекла.

Предварительно из пробирки или флакона удаляют питательную среду, затем в пробирку вносят 0,5 мл раствора версена, а во флаконы-матрацы объемом 150-200 мл - 10 мл и 25 мл версена соответствен­но. Сосуды помещают в термостат на 20-30 мин, после чего слегка встряхивают. Взвесь вносят в пробирки, центрифугируют при 1000 об/мин 5-10 мин, раствор версена удаляют, а клетки ресуспендируют в питательной среде, Подсчитывают в камере Горяева концентрацию клеток и взвесь разводят до концентрации 200000 клеток в 1 мл. Взвесь вносят по 1-2 мл в пробирки. Пробирки закрывают резиновыми пробками, отмечают карандашом по стеклу лицевую сторону пробирок и помещают их в наклонном положении в термостат.

Подсчитать концентрацию смытых клеток с помощью камеры Горяева и сделать посев культуры клеток в пробирки.

7.Просмотреть монослой выросших клеток и заразить культуру ткани вирусом осповакцины. Техника заражения состоит в следующем. Вирус вакцины разводят синтетической средой 199 в отношении 1:3 и обрабатывают антибиотиками. Из пробирки с культурой ткани стерильной пастеровской пипеткой отсасывают питательную среду. В пробирку вносят I мл разведенного средой вируса вакцины, плотно закрывают ее резиновой пробкой и помещают в термостат в горизонтальном штативе.

8.Существует несколько методов заражения куриных эмбрионов: на хорионаллантоисную) оболочку, в аллантоисную полость, амниотическую полость, в желточный мешок. Для заражения используют эмбрионы 5-11-дневного возраста. Перед заражением эмбрионы просматривают в темной комнате при помощи овоскопа для проверки их жизнеспособности (живые эмбрионы подвижны с хорошо развитыми сосудами) и определения воздушной камеры и места расположения эмбриона. Место на столе, где производят манипуляции, покрывают салфеткой, смоченной в растворе хлорамина.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку.Яйцо устанавливают в штативе в вертикальном положении тупым концом вверх. Скорлупу над воздушной камерой обрабаты­вают спиртом, йодом, повторно спиртом, обжигают, прокалывают ножни­цами небольшое отверстие, через которое в полость воздушного мешка вводят одну браншу ножниц и срезают скорлупу над ним. Затем анатомическим пинцетом захватывают в складку и осторожно снимают внутренний листок подскорлуповой оболочки. Под ней находится хорионаллантоисная оболочка, на которую пастеровской пипеткой наносят исследуемый материал в количестве 0,2-0,5 мл. Отверстие скорлупы закрывают стерильным стеклянным колпачком, который закрепляют на яйце расплавленным парафином. Зараженное яйцо помещают в термостат при 37^°на 48 часов.

3аражение в аллантоисную полость.После подготовительной работы скорлупу прокалывают над воздушной камерой и через небольшое отверстие вводят иглой шприца или пастеровской пипеткой на глубину 1-1,5 см материал в объеме 0,1-0,2 мл. Отверстие заливают парафи­ном.

Заражение в амниотическую полость.После удаления скорлупы над воздушной камерой бранши пинцета вводят в аллантоисную полость в направлении эмбриона на глубину 2-2,5 см, захватывают амниотическую оболочку, выводят ее из глубины, прокалывают иглой шприца и в амниотическую полость вводят материал в количестве 0,1 мл. Отверстие в скорлупе закрывают колпачком и парафинируют.

Заражение в желточный мешок(этим методом чаще пользуются для выделения риккетсий). Просмотреть 5-8-дневный эмбрион с помощью овоскопа, отметить границу воздушной камеры и место расположения эмбриона. Исследуемый материал вводят эмбрионам длинной иглой (4-5 см) через небольшое отверстие в скорлупе над воздушной камерой на глубину 2-3 см. При этом надо не повредить зародыш. Во время манипуляции он должен находиться ниже желточного мешка.

Ввести эмбриону на хорионаллантоисную оболочку вирус осповакцины или в аллантоисную полость вирус гриппа.

Контрольные вопросы

Чем отличаются вирусы от всех остальных живых организмов?

Что такое вирион? Что такое капсид, нуклеокапсид, пеплос (суперкапсид)?

Какой тип симметрии может иметь нуклеокапсид?

Какие признаки используются для классификации вирусов?

Почему вирусы считаются облигатными паразитами?

Какие методы используются для культивирования вирусов?

Как заражают новорожденных мышеи?

Что собой представляют тельца Негри и какими методами их окрашивают?

Что такое культура ткани?

Ткани каких органов используются для получения культур клеток?

Как получают культуру первично-трипсинизированной ткани?

Что такое перевиваемые культуры ткани?

Какие Вы знаете штаммы перевиваемых клеток?

Какие среды и солевые растворы применяют для выращивания и для обработки культур ткани?

Как подсчитывают количество клеток и с какой целью?

В каком положении ставят пробирки в термостат и сколько вре­мени выращивают клетки до заражения их вирусом?

По каким признакам судят о размножении клеток?

Как делают пересев клеток для поддержания данного штамма в лабораторных условиях?

Как отбирают пробирки с культурой ткани для заражения вирусом?

Как выглядят растущие клетки?

Как готовят вируссодержащий материал для заражения культуры ткани?

На сколько времени ставят зараженные пробирки в термостат?

Каково строение куриного эмбриона?

Какого возраста эмбрионы используются для заражения?

Как определяет место расположения эмбриона при овоскопии?

Как обрабатывается эмбрион перед заражением?

Какие существуют метода заражения куриного эмбриона?

На сколько времени ставят зараженный эмбрион в термостат для размножения вируса?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 8.

А. Основные отличия вирусов от других живых организмов.

1. Вирусы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа - ДНК или РНК. Все другие организма содержат нуклеиновые кислоты обоих типов.

2. Воспроизведение вирусов осуществляется из одной их нуклеиновой кислоты, в то время как прочие организмы репродуцируются из совокупности своих составных частей.

3. Вирусы не способны к росту и бинарному делению.

4. У вирусов отсутствуют собственные знергообразующие системы.

5. У вирусов нет собственных белоксинтезирующих систем.

Отсутствие у вирусов собственных энергообразующих и белоксинтезирующих систем характеризует их как абсолютных внутриклеточных паразитов.

Б. Критерии современной классификации вирусов.

1. Нуклеиновая кислота: тип, число нитей, процентное содержа­ние, молекулярная масса, содержание гуанина и цитозина.

2. Морфология: тип симметрии или псевдосимметрия, число капсомеров для вирусов с кубической симметрией, наличие внешней липопротеидной оболочки, форма, размеры вирионов.

3. Биофизические свойства: константа седиментации, плавучая плотность.

4. Белки: количество структурных белков и их локализация, аминокислотный состав.

5. Липиды.

6. Размножение в тканевых культурах: особенности репликации.

7. Круг поражаемых хозяев: особенности патогенеза инфекционного процесса; онкогенные свойства.

8. Устойчивость к физическим и химическим факторам (гамма-лучи, термоинактивация при 37^° С и 56^° С , действие жирорастворителей и отдельных катионов).

9. Антигенные свойства.

В. Для культивирования и выделения вирусов используют следующие методы:

а) заражение лабораторных животных;

б) заражение куриных эмбрионов;

в) заражение культур тканей (клеток).

Характеристика культур тканей.

I. Однослойные культуры клеток

1. Первично-трипсинизированная культура ткани – взвесь клеток, полученная путём обработки тканей протеолитическими ферментами (трипсин, папаин и др.). Трипсинизацией достигается разделение кле­ток за счет переваривания межклеточного вещества. Такие клетки, помещенные в питательную среду, растут в виде монослоя и дают однослойную культуру ткани. Первично-трипсинизированная культура ткани выдерживает несколько пересевов, а затем погибает.

2. Перевиваемые клетки - культура клеток, сохраняющая способность к размножению вне организма неопределенно длительное время.

II. Суспензии клеток.

Г. Типы вирусных геномов

РНК-геномы

1. Одноцепочечная нефрагментированная РНК, обладающая матричной актив­ностью (позитивная, или +РНК). Пикорнавирусы, флавивирусы, тогавирусы и др.

2. Одноцепочечная нефрагментированная РНК, не обладающая матричной активностью (негативная, или –РНК). Вирион имеет в своем составе фермент РНК-зависимую-РНК-полимеразу (транскриптазу). Она синтезирует на вирионной РНК матричную РНК, необходимую для трансляции вирусспецифических белков. Парамиксовирусы, рабдовирусы и др.

3. Одноцепочечная фрагментированная РНК, не обладающая матричной актив­ностью (негативная РНК); вирион имеет транскриптазу. Ортомиксовирусы (РНК вириона состоит из 8 фрагментов).

4. Двухцепочечная фрагментированная РНК; вирион имеет транскриптазу. Реовирусы (10 фрагментов).

5. Вирусы, геном которых представлен двумя идентичными нитями позитивной РНК (диплоидный геном). Вирионы имеют обратную транскриптазу. Ретровирусы.

6. Одноцепочечная кольцевая РНК. Такой геном имеет только один вирус — вирус дельта-гепатита. Это дефектный вирус, для размножения его необходим ви­рус-помощник (вирус гепатита В).

ДНК-геномы

1. Одноцепочечная линейная ДНК. Парвовирусы: «+» и «—» нити находятся в разных вирионах, но транскрибируется только «—» нить.

2. Одноцепочечная кольцевая ДНК. Фаги М13, φX174.

3. Двухцепочечная линейная ДНК. Вирусы герпеса и др.; ранняя мРНК синтези­руется в ядре клеточным ферментом.

4. Двухцепочечная кольцевая ДНК. Паповавирусы, вирус гепатита В и др.; ранняя мРНК синтезируется в ядре клеточным ферментом.

5. Двухцепочечная ДНК с ковалентно связанным терминальным гидрофобным белком. Аденовирусы; ранняя мРНК синтезируется клеточным ферментом в ядре.

6. Двухцепочечная ДНК, замкнутая на каждом конце ковалентной связью. Вирус оспы; размножение происходит в цитоплазме, ранняя мРНК синтезируется вирус­ным ферментом.

Д. Особенности репликации вирусов

1. Двунитчатая ДНК - обычная полуконсервативная репликация.

2. Однонитчатая ДНК – репликация происходит через стадии репликативной формы и промежуточной репликативной формы.

3. Однонитчатая РНК – репликация происходит через две стадии. Вначале на вирионной РНК (вРНК) синтезируются комплементарные РНК (кРНК). Затем на кРНК синтезируются вирионные РНК.

4. Репликация однонитчатой РНК ретровирусов происходит с участием обратной транскриптазы. Вначале на вРНК обратная транскриптаза синтезирует минус-цепь ДНК, а затем на ней синтезирует плюс-цепь ДНК. Двунитевая ДНК служит матрицей для синтеза вРНК.

5. Размножение вируса гепатита В также протекает с участием обратной транскриптазы. Вначале клеточная РНК-полимераза синтезирует на вирусной ДНК прегеномную РНК, а затем вирусная обратная транскриптаза синтезирует на ней минус-цепь ДНК, на которой затем достраивает плюс-цепь ДНК.

Е. Методы микробиологической диагностики вирусных заболеваний

1. Вирусоскопический– обнаружение в исследуемом материале с помощью методов электронной микроскопии вирионов или с помощью светооптической микроскопии вирионов или внутриклеточных включений.

2.Обнаружение вирусов в исследуемом материале с помощью методовиммуноэлектронной микроскопии.

3.Вирусологические методы– выделение чистых культур вирусов и их идентификация с использованием культур клеток или куриных эмбрионов.

4.Серологические методы– обнаружение противовирусных антител в сыворотке больного или реконвалесцента с помощью реакций нейтрализации вирусов, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации, иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного метода (РИМ), реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), реакции гемагглютинации иммунного прилипания (комплекс АГ+АТ в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах), реакции преципитации в агаре, иммунофлуоресцентного метода. Эти же реакции могут быть использованы и для обнаружения вирусных ан­тигенов в исследуемом материале.

5. Биологические методы– заражение чувствительных к данному вирусу лаборатор-ных животных с целью воспроизведения заболевания или последующего выделения вируса.

6. Молекулярно-генетический– с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или гибридизации нуклеиновых кислот (ДНК- и РНК-зонды) определяют в исследуемом материале наличие возбудителя вирусного заболевания по специфичным для него последовательностям нуклеотидов.

З А Н Я Т И Е 9

Дата ______________

Тема: Идентификация вирусов. Серодиагностика. Генетические методы диагностики (молекулярная гибридизация, полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Итоговое контрольное занятие «Общая вирусология и генетика».

План занятия:

1.Культивирование вирусов в культурах тканей (окончание):

а) изучение цитопатического эффекта - макро- и микроскопии культур клеток, зараженных вирусом осповакцины;

б) выявление размножения вирусов в культуре ткани реакцией гемадсорбции (демонстрация готовых препаратов);

в) обнаружение вируса в культуре ткани методом цветной пробы (демонстрация);

г) выявление вируса в культуре ткани методом бляшек (демонстрация);

д) обнаружение вируса в культуре ткани с помощью флуоресцирующих антител. Разбор методики.

2. Культивирование вирусов в курином эмбрионе (окончание):

а) вскрытие зараженных куриных эмбрионов и изучение изменений в них;

б) постановка реакции гемагглютинации;

в) определение типа вируса гриппа в аллантоисной жидкости с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

3. Итоговый контроль по теме «Общая вирусология и генетика МО».

Методические указания

1.а)Цитопатический эффект- дегенерация клеток, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса. Микроскопически цитопатическое действие выражается в различных изменениях морфологии клеток, образовании гигантских многоядерных клеток (симпластов), пикнозе ядер и, наконец, в полной деструкции клеток. Макроскопически заметно слущивание клеток со стенок пробирки. Характер клеточной дегенерации зависит, в основном, от вида вируса.

Промикроскопировать культуру ткани, зараженную вирусом осповакцины. Зарисовать.

б) Гемадсорбция – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток.

Методика реакции. В пробирки о зараженной вирусом культурой ткани вносят 0,2 мл 0,4% взвеси эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют в наклонном положении. Длительность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубация и вида вируса. Учёт реакции производят под малым увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксированы на клетках и сохраняются на них после 1-2-кратного отмывания. Адсорбируясь на поверхности пораженных вирусом клеток, эритроциты образуют характерные скопления.

Зарисовать картину гемадсорбции.

Культура клеток, зараженная вирусом _______________ (цитопатический эффект) окраска по Романовскому	Реакция гемадсорбции окраска по Романовскому

в) Цветная реакция. В основу реакции положено то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, снижающие рН среды. В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, в силу чего подавляется их метаболизм и не происходит изме­нение рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый красный. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7 – оранжевый и при рН ниже 7 – желтый.

Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой), рH питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. В случае размножения вируса клетки дегенерируют, и среда сохраняет исходный красный цвет.

Метод цветных проб может быть использован для титрования ви­руса или вируснейтрализирующих антител.

Цветные пробы зарисовать.

г) Метод бляшекпредложен Р. Дюльбекко для получения изолированных колоний вируса. В основе метода лежит появление в монослое зараженных вирусом клеток обесцвеченных участков, состоящих из дегенерированных клеток. Эти участки, получившие название бляшек, представляют собой колонии вируса, образующегося из одной вирусной частицы.

Метод заключается в следующем. В специальном флаконе на стенке выращивают монослой клеток, затем удаляют питательную среду. Клетки заражают вирусом и заливают агаром, содержащим индикатор нейтральный красный. Там, где происходит рост клеток, среда изменится в кислую сторону, и индикатор окрасится в розовый цвет. На тех участках, где клетки погибли под действием вируса, рН среды и, следовательно, цвет индикатора не изменяется. Такие островки неокрашенной среды имеют вид беловатых бляшек разной формы и величины, что зависит от вида вируса.

Феномен бляшкообразования зарисовать.

Метод цветных проб: 1 – культура ткани, не заражённая вирусом; 2– культура ткани, заражённая вирусом	Культура ткани, заражённая вирусом полиомиелита (феномен бляшкообразования)

д) Метод флуоресцирующих антителоснован на появлении специфического свечения в местах локализации вируса при обработке зараженной ткани флуоресцирующими антителами. Заражаемую культуру ткани выращивают на стеклянных пластинках. Препарат промывают физиологическим раствором, подсушивают и фиксируют в ацетоне при 4^°С в течение 10 мин. Затем препарат окрашивают специфической флуоресцирующей сывороткой в течение 30 мин при 37^°С. После окраски препарат промывают физиологическим раствором и высушивают. Просмотр препарата производят с помощью люминесцентного микроскопа.

2.а) Вскрытие куриных эмбрионов. Работу проводят в стерильных условиях. Яйцо ставят воздушным мешком кверху, место вскрытия смазывают спиртом, йодом, еще раз спиртом, обжигают, снимают колпачок и ножницами удаляют прилегающую к отверстию часть скорлупы. Пинцетом снимают подскорлупную обо­лочку, прокалывают пастеровской пипеткой хорионаллантоисную обо­лочку и из полости отсасывают аллантоисную жидкость, содержащую вирус. Жидкость помещают в стерильную пробирку.

Для исследования хорионаллантоисной оболочки из яйца удаляют всё содержимое. Оболочка остается на внутренней поверхности скорлупы или выпадает вместе с содержимым яйца. Оболочку осторожно вынимают пинцетом, помещают в чашку Петри, промывают физиологиче­ским раствором, тщательно расправляют и рассматривают на темном фоне изменения, имеющиеся в ней. Изменения на оболочке строго специфичны. Например, вирус осповакцины вызывает образование многочисленных беловатых втянутых в центре бляшек.

б) Реакция гемагглютинации. Аллантоисную жидкость проверяют на содержание вируса путем агглютинации куриных эритроцитов на стекле (и в пробирках - титрование вируса). Для постановки реакции на стекле к капле вируссодержащего материала добавляют одну каплю 5% взвеси эритроцитов. Реакция проходит в течение 5 мин.

Реакция гемагглютинации

1 – опыт (к капле аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа, добавляют каплю 5% взвеси куриных эритроцитов) 2 – контроль (эритроциты + физ. р-р).

в)Реакция торможения гемагглютинации(РТГА) может быть использована для определения типа ви­руса или типа и титра антител. Для определения типа вируса на пред­метное стекло наносят по одной капле вирусосодержащего материала (количество капель должно соответствовать количеству сывороток). В приготовленные капли последовательно вносят по одной капле типовых сывороток. Контролем служит физиологический раствор и нормальная сыворотка. Затем в каждую каплю вносят по одной капле 5% взвеси эритроцитов. Результат регистрируют через 5 мин. При соответствии вируса типу сыворотки антитела связывают гемагглютинин вируса, и гемагглютинация не наступает (РТГА положительная). Эта реакция может быть поставлена и в пробирках с целью титрования вируса или анти­тел (антигемагглютининов).

Схема определения типа вируса реакцией торможения гемагглютиниции.

	В каплю вируссодержащей жидкости добавляют каплю типовой сыворотки и каплю 5% взвеси эритроцитов. К– контроль (эритроциты + физ. раствор).
Заключение:__________________________________________________________ _____________________________________________________________________

Контрольные вопросы

Как обнаруживают наличие вируса в культуре ткани?

Почему при размножении вируса цвет среды не изменяется?

С какой целью может быть использован метод цветных проб?

Какие изменения наступают в клетках при размножении вируса?

Как ставят реакцию гемадсорбции? Как выглядит положительная реакция гемадсорбции?

Что собой представляет метод бляшек?

Как обнаруживают вирус гриппа в курином эмбрионе?

Как вскрывают зараженный эмбрион?

Почему происходит реакция агглютинации эритроцитов в присутст­вии вируса гриппа? Каков механизм этой реакции?

Что такое реакция торможения (нейтрализация) гемагглютинации? Для чего она используется?

Как обнаруживают изменения в хорионаллантоисной оболочке, вы­званные вирусом?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 9.

Классификация цитопатического действия (ЦПД) вирусов в культуре ткани.

1. Равномерная мелкозернистая деструкция клеток (вирусы Коксаки, ЕСНО, полиовирусы).

2. Очаговая мелкозернистая дегенерация (вирусы гриппа, клещевого энцефалита и др.).

3. Гроздевидная дегенерация (аденовирусы).

4. Крупнозернистая равномерная деструкция (вирус герпеса).

5. Симпластообразование (обезьяньи вирусы, вирусы кори, осповакцины, RS-вирус).

Методы обнаружения вируса в культуре ткани

1. Цитопатический эффект.

2. Реакция гемадсорбции.

3. Метод цветных проб.

4. Метод бляшек.

5. Иммунофлуоресцентный метод.

6. Реакция связывания комплемента.

7. Реакция гемагглютинации.

8. Заражение животных, восприимчивых к данному вирусу.

9. Реакция преципитации в агаре.

Методы определения типа вирусов (идентификация, типирование вирусов)

Определение типа вирусов в вируссодержащем материале основа­но на реакции нейтрализации биологического действия вируса (РНБД) типоспецифическими сыворотками. Конечный результат реакции может быть установлен на основании следующих признаков:

1) нейтрализация ЦПД;

2) нейтрализация реакции гемадсорбции;

3) цветная проба;

4) задержка (торможение) гемагглютинации;

5) свечение клеток, содержащих вирус, под влиянием типоспецифических флуоресци-рующих сывороток;

6) нейтрализация в опыте на животных.

Вопросы к итоговому контролю «Общая вирусология и генетика МО».

1. Чем вирусы отличаются от всех остальных живых организмов?

2. Что такое вирион, капсид, нуклеокапсид, тип симметрии, суперкапсид?

3. Критерии классификации вирусов.

4. Типы вирусных геномов.

5. Методы культивирования вирусов.

6. Заражение лабораторных животных. Правила, способы.

7. Заражение куриных эмбрионов. Правила, способы.

8. Культуры клеток (тканей). Определение, классификация, получение.

9. Признаки размножения вирусов в курином эмбрионе.

10. Методы обнаружения вируса в культуре клеток.

11. Цитопатический эффект, определение, классификация.

12. Методы типирования вирусов.

13. Сущность реакции гемадсорбции.

14. Сущность метода цветных проб.

15. Сущность метода бляшек.

16. Сущность реакции гемагглютинации для обнаружения вирусов.

17. Методы микробиологической диагностики вирусных инфекций.

18. Что такое вирусоскопический метод диагностики?

19. Что такое вирусологический метод диагностики?

20. Типы вирусных инфекций.

21. Особенности и механизмы противовирусного иммунитета.

22. Механизмы персистирования вирусов в организме.

23. Механизмы проникновения вируса в клетку.

24. Где в хозяйской клетке размножаются ДНК- и где РНК-содержащие вирусы?

25. Стадии взаимодействия вируса с клеткой.

26. Что такое вирогения?

27. Механизмы противовирусного действия интерферона.

28. Что такое протоонкоген и онкоген?

29. Формы обмена генетическим материалом у бактерий.

30. Что такое конъюгация, ее механизм.

31. Что такое трансдукция, ее механизмы?

32. Что такое плазмиды, их биологические особенности.

33. Основные классы плазмид.

34. Бактериофаги. Их химический состав и морфология.

35. Типы инфекций, вызываемых бактериофагом. Их особенности.

36. Какая разница между вирулентным и умеренным бактериофагом?

37. Что такое лизогения? Лизогенная конверсия?

38. Стадии взаимодействия Т-чётного фага с бактериальной клеткой.

39. Для чего используются фаги в медицинской практике?

40. Что такое фаготипирование?

З А Н Я Т И Е 10

Дата ______________

Тема: Микрофлора окружающей среды и организма человека. Санитарно-показательные микроорганизмы (СПМО). Санитарно-бактериологическое исследование воды, воздуха, почвы (1 день).

План занятия:

1. Знакомство с микрофлорой человеческого тела: посев отпе­чатков пальцев, посев слизи из зева.

2. Разбор понятия «санитарно-показательные микроорганизмы», знакомство с их основными группами.

3. Санитарно-бактериологическое исследование воды питьевой:

а) определение ОМЧ (разбор схемы);

б) титрационный метод (разбор схемы);

в) метод мембранной фильтрации (разбор схемы).

4. Санитарно-бактериологическое исследование воздуха:

а) посев воздуха седиментационным методом Р. Коха;

б) аспирационный метод (разбор).

5. Санитарно-бактериологическое исследование почвы (разбор).

а) определение общего количества бактерий в почве;

б) определение бактерий группы кишечных палочек (бродильный (титрационный) метод, метод мембранных фильтров, прямой поверхностный посев на плотные питательные среды);

в) определение перфрингенс-титра (посев почвенных разведений в среду Вильсона-Блера, использование сред накопления для определения клостридий в почве);

г) определение нитрифицирующих бактерий.

Методические указания

1.Сделать посев отпечатков пальцев руки на пластинки МПА и среды Эндо.

При помощи стерильного ватного тампона взять материал со сли­зистой оболочки зева и произвести посев на простой и кровяной МПА.

2.Критерии для СПМО (разбор). Три группы СПМО.

3.Разбор нормируемых микробиологических показателей качества воды: общее микробное число (ОМЧ), общие колиформные бактерии (ОКБ), термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ), коли-фаги.

а) Определение ОМЧ (разбор схемы).

Для определения ОМЧ воды чаще всего используют метод 10-кратных разведений, когда концентрация микроорганизмов каж­дого последующего разведения в 10 раз меньше предыдущего, затем разведения высевают на питательные среды. В пустые стерильные чашки Петри, соблюдая правила асептики, стерильной пипеткой вносят 1 см³ из заранее приготовленного разведения. Чашки предварительно маркируют (со стороны донышка, а не крышки!), чтобы исключить случайную замену их при падении, сдвиге и др.

Разведения выбирают с таким расчётом, чтобы на чашке выросло от 30 до 300 колоний. Из каждой пробы засевают два разведения. Не позднее чем через 15 мин после внесения материала (разведения) в чашку наливают расплавленного и остуженного до 45⁺5°С 10-12 см³ питательного агара (питательную среду), толщина слоя которого должна быть 4-5 мм. Расплавленную среду и посевной материал незамед­лительно тщательно перемешивают круговыми движениями, чтобы микроорганизмы равномерно распределились в массе среды. Чашки Петри оставляют на холодной горизонтальной поверхности на 10-15 мин для охлаждения и застывания среды, после чего посевы помещают в термостат и инкубируют при заданной температуре и экспозиции.

Для дальнейшей работы выбирают чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний, а при посеве нативного материала - от 1 до 300 колоний. Количество колоний на поверхности и в глубине агара подсчитывают визуально или при помощи лупы с 2-5-кратным увеличением.

б) Определение ОКБ и ТКБ титрационным методом.

         Метод основан на накоплении бактерий после посева определенных объемов воды в жидкие питательные среды, с последующим пересевом на дифференциальную плотную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам. При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий санэпиднадзор) засевают три объема по 100 см³. При исследовании воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ (повторный анализ) засевают соответственно 100, 10 и 1 см³— по три объема каждой серии.

в) Определение ОКБ и ТКБ методом мембранных фильтров.

         Метод основан на фильтровании определенных объемов воды через мембранные фильтры. Для этих целей используют фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером 35 или 47 мм в диаметре (отечественные фильтры «Владипор» МФАС–С–1, МФАС–С–2, МФАС–МА (№ 4–6) или зарубежные — ISO9000 или EN 29000). При исследовании воды неизвестного качества для получения изолированных колоний фильтруют следующие объёмы воды: 10, 40, 100 и 150 см³соответственно на 4 фильтра. Далее фильтры помещают на чашки со средой Эндо и инкубируют при 37°С или 44°С в течение 24 ч. Если на фильтрах нет роста колоний или отмечен рост плёнчатых, губчатых, плесневых, прозрачных или расплывчатых колоний, то выдаётся отрицательный ответ.

4.Для санитарно-бактериологической оценки состояния воздуха используют седиментационный и аспирационный методы.

а) Седиментационный метод Коха прост, не требует специальной аппаратуры. Суть метода: чашка с питательной средой ставится на рабочем столе, открывается на 10 мин, закрывается и ставится в термостат, где выдерживается двое суток при температуре 37°С, а затем двое суток при комнатной температуре. После этого проводится подсчет выросших колоний по формуле Омелянского.

Для выявления грибов в воздухе посев проводится на среду Сабуро, и чашка выдерживается при 22-25°С до 5 суток. Для выявления патогенных бактерий посевы проводят на дифференциально-диагностические среды: для золотистого стафилококка — на желточно-солевой агар, для энтеробактерий — на среду Эндо с добавлением генцианвиолетта (для торможения роста сапрофитов), для псевдомонад — на среду № 9 (ГФ XI, т. 2). Чашки выдерживают в открытом виде 1 час, после чего ставят в термостат для культивирования при 37°С на двое суток с последующим выдерживанием при комнатной температуре в течение 2 суток.

Расчет по модифицированной формуле Омелянского ведется на 1 м²поверхности:

X=n^.10⁴/^.r^2.t,

где X- ОМЧ воздуха обследуемого помещения (КОЕ);п -количество колоний на чашке (КОЕ);t -время экспозиции чашки (мин); ^.r^{2 -}площадь чашки Петри (см²); 10⁴- пересчет м²в см².

Формула Омелянского, даже модифицированная, имеет ряд существенных недостатков: 1) нельзя определить точный объем воздуха, из которого микробы оседают на чашку; 2) мелкодисперсная фаза аэрозоля (а с ним и микробы) практически не оседает и токами воздуха постоянно поддерживается во взвешенном состоянии.

Результаты, получаемые с помощью этого метода, позволяют сравнить, сопоставить степень микробной обсемененности разных помещений и ориентироваться при разработке мероприятий по очищению воздушной среды.

б) Аспирационный метод изучения микрофлоры воздуха основан на использовании ударной струи воздуха, получаемый с помощью аппарата Кротова или других подобных ему аппаратов (импактеры (ПУ-1Б), импинджеры (ПОВ-1), система HiAir Petri^TM. Последняя позволяет пропускать до 1000 л воздуха за 200 сек.). Достоинства этого метода:

- точно учитывается объем воздуха, пропускаемого через чашку с питательной средой, установленную в аппарате;

- принцип ударной струи воздуха способствует фиксации на влажной поверхности питательной среде всех взвешенных частиц аэрозоля.

Таким образом, удается фиксировать на поверхности плотной питательной среды максимальное количество микроорганизмов, обитающих в воздухе. Используя различные виды элективных и дифференциально-диагностических питательных сред, можно выявлять в воздухе все основные группы патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

5.Для санитарно-бактериологической оценки состояния почвы используют определение общего количества бактерий, бактерий группы кишечной палочки, а также определение перфрингенс-титра и нитрифицирующих бактерий.

а) При определении общего количества бактерий в почве посев проводят в 1,5% МПА – не менее двух различных разведений пробы в зависимости от степени предполагаемого загрязнения исследуемой почвы. Перед посевом каждое разведение тщательно перемешивают стерильной пипеткой, забирают 1 см³суспензии и переносят на дно стерильной чашки Петри. Из каждого разведения посев проводят минимум в две параллельные чашки. После этого в чашки вливают 15-20 см³предварительно расплавленного и остуженного до температуры 45 °С питательного агара, тщательно перемешивают с почвенной суспензией и оставляют до застывания в строго горизонтальном положении. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат в перевёрну­том виде (крышкой вниз) при температуре 37 °С на 24 ч. После инкубации подсчитывают выросшие колонии и проводят пересчёт на 1 г почвы.

б) Определение бактерий группы кишечных палочек проводят несколькими методами: бродильным (титрационным), методом мембранных фильтров и прямым поверхностным посевом в плотные питательные среды.

Бродильный (титрационный) метод. При анализе почвы с невысокой степенью фекального загрязнения рекомендуют проводить определение БГКП титрационным методом с использованием среды Кесслер или лактозного бульона с трифенилтетразолием хлорида (ТТХ). 10 см³почвенной суспензии первого разведения (1:10) засевают во флакон с 50 см³среды, что соответствует посеву 1 г почвы. Последующие разведения высевают по 1 см³в пробирки с 9 см³той же среды. Перед посевом в каждую пробирку с лактозным бульоном добавляют 0,3 см³ 2% водного раствора ТТХ, а в каждый флакон – по 1,5 мл. Методика посева с использованием ТТХ основана на способности кишечной палочки восста­навливать бесцветное соединение ТТХ в трифенилформазан, выпадающий в осадок, придающий среде коричнево-красный цвет. Кишечная палочка устойчива к действию формазана, в то время как развитие другой микро­флоры подавляется. Посевы на среде Кесслер-Свенертона инкубируют 48 ч при температуре 43 или 37 °С. Отсутствие через 48 ч газообразования и помутнения в бродильных сосудах позволяет дать отрицательное заключение о наличии БГКП. Отрицательное заключение при использовании лактозного бульона с ТТХ дают через 24 ч в том случае, если в пробирках и флаконах цвет среды не изменился. При наличии признаков бактери­ального роста проводят высев на среду Эндо или розоловый агар. Чашки с посевами инкубируют при температуре 37 °С 24 ч. В случае отсутствия при­знаков роста на чашках дают отрицательное заключение. Красные, розовые с металлическим блеском, жёлтые и оранжевые колонии на розоловой среде типичны для кишечных палочек. На заключительном этапе исследования проводят идентификацию выросших на агаризованных средах характерных колоний (аналогично анализу БГКП в воде). Результаты анализа выражают коли-титром.

Метод мембранных фильтров используют в качестве ускоренного метода анализа слабозагрязнённых почв. Через стерильные мембранные фильтры № 3 с помощью фильтровального аппарата Зейтца пропускают 5–10 см³ почвенной суспензии первого разведения, которую предварительно центрифугируют при 2000 об./мин в течение 5 мин. Дальнейшее исследование проводят аналогично анализу БГКП в воде методом мембранных фильтров.

Прямой поверхностный посев на плотные питательные среды применяют для исследования почвы из мест интен­сивного фекального загрязнения. Проводят прямой поверхностный посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,05 см³ на среды Эндо. При анализе сравнительно чистых почв посев проводят из раз­ведений 1:10-1:100, для загрязнённых почв используют разведение 1:10⁶. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 °С в тече­ние 24 ч. На следующем этапе исследования идентифицируют выде­ленные бактерии (аналогично определению БГКП в воде).

Результаты двух последних методов исследований выражают коли-титром или коли-индексом.

в) Определение перфрингенс-титра проводят по двум общепринятым методикам.

Посев почвенных разведений в среду Вильсона-Блера. Из всех почвенных разведений (до 1:10⁶) образцы по 1 см³перено­сят в 2 параллельных ряда пробирок. Один ряд пробирок прогревают при температуре 80 °С в течение 15 мин и/или при 90 °С – 10 мин. Затем во все пробирки добавляют по 9-10 см³свежеприготовленной среды Вильсона-Блера. Инкубацию посевов проводят при температуре 37 или 43 °С в течение 24 ч. Учёт можно проводить и несколько раньше, так как санитарно-показательные клостридии, преимущественноС. perfringens, через несколько часов образуют колонии чёрного цвета. Обнаружение в мазках колоний характерных грамположительных палочек указывает на наличиеС. perfringens. Общепринятая методика определенияС. perfringensна среде Вильсона-Блера имеет существенный недостаток – питательная среда в определённой степени ингибирует рост микроорганизма. Для устранения этого явления предложена модификация методики.

Использование сред накопления для определения клостридий в почве.По 1 см³прогретых и нативных почвенных разведений засевают в пробирки с полужидкими и жидкими питательными средами, предварительно регенерированными кипячением (Клодницкого, Китт-Тароцци, бульона Мартена с ватой и др.). После инкубации посевов в течение 18-20 ч при температуре 37 °С проводят высев 0,5-1 см³материала из помутневших пробирок в среду Вильсона-Блера или сульфит-полимиксин-неомициновую среду. Посев, инкубацию и учёт при этом проводят аналогично первому способу.

г) Для определения нитрифицирующих бактерийсеют почвенные разведения во флаконы с минеральной средой Виноградского, разлитой тонким слоем. В ходе эксперимента два флакона со средой оставляют незасеянными в качестве контроля чистоты среды. Посевы инкубируют при температуре 28 °С в течение 14-15 сут. При развитии нитрифицирующих бактерий в среде образуются азотистая и азотная кислоты, которые определяют на 5-7 сутки после посева и вторично – на 14-15. Титр нитрифицирующих бактерий определяют качественной реакцией с дифениламином, который в присутствии азотистой и азотной кислот даёт синее окрашивание. Пастеровской пипеткой несколько капель среды из каждого флакона, не взмучивая осадок, переносят на стеклянную или фарфоровую пластинку, добавляют несколько капель дефениламина, разведённого концентрированной серной кислоте. Синее окрашивание указывает на присутствие в среде продуктов метаболизма нитрифицирующих бактерий. Среда контрольных флаконов должна оставаться без изменения окраски.

Контрольные вопросы

Какие микроорганизмы называют санитарно-показательными?

В чем сущность прямого метода санитарной оценки объектов внешней среды?

Какие существуют показатели-критерии косвенного метода индикации микроорганизмов внешней среды?

Что такое общее микробное число, и какие методы его определения вы знаете?

Какие микроорганизмы относятся к первой группе СПМО?

Какие бактерии называют колиформными?

Какие колонии образуют на среде Эндо типичные лактозоположительные бактерии?

Какие микроорганизмы относятся ко второй группе СПМО?

Что такое титр СПМО?

Что такое индекс СПМО?

Какие микробиологические показатели определяют при оценке качества питьевой воды централизованного водоснабжения?

Как определяют ОМЧ воды?

Что такое ОКБ и ТКБ?

В чем сущность метода мембранных фильтров при определении ОКБ и ТКБ воды?

Какие фильтры используют при исследовании воды?

Какие методы обнаружения микроорганизмов в воде вы знаете?

Как определяется ОКБ в почве?

Какие методы используются для определения БГКП в почве?

В чем сущность бродильного метода определения БГКП?

В каких случаях используется прямой поверхностный посев почвы на плотные питательные среды?

Что такое перфрингенс-титр, и какими методами он определяется?

Какие питательные среды используют для определения перфрингенс-титра?

Какие СПМО почвы вы знаете?

Какие показатели определяют при санитарном анализе почвы?

Какую роль в почве выполняют аммонификаторы и нитрификаторы?

Какие микробиологические показатели определяются при исследовании воздуха?

Что такое резидентная микрофлора воздуха?

Что такое транзиторная микрофлора воздуха?

Какие санитарно-показательные микроорганизмами при исследовании воздуха в закрытых помещениях вы знаете?

На каком принципе основан метод Коха при санитарно-микробиологическом исследовании воздуха?

Какие недостатки имеет метод Коха?

Как можно использовать результаты, полученные при исследовании воздуха методом Коха?

В чем сущность аспирационного метода изучения микрофлоры воздуха?

Какие приборы для отбора проб воздуха вы знаете?

Какие достоинства имеет аспирационный метод исследования воздуха?

Что такое общая бактериальная обсемененность воздуха?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 10.

Санитарно-показательныминазывают микроорганизмы, являющиеся постоянными обитателями естественных полостей тела человека и животных, которые способны постоянно выде­ляться во внешнюю среду.

Санитарно-показательные микроорганизмы должны соответствовать следующим требованиям.

1. Постоянное обитание в естественных полостях человека и живот­ных и постоянное выделение во внешнюю среду.

2. Отсутствие размножения во внешней среде.

3. Длительность выживания и устойчивость во внешней среде не меньше или даже выше, чем у патогенных микроорганизмов.

1. Отсутствие «двойников», с которыми СПМО можно перепутать.

2. Относительно низкая изменчивость во внешней среде.

6. Наличие простых в исполнении и надёжных методов индикации.

В качестве СПМО предложено довольно много микроорганизмов, их можно условно разделить на три группы.

          • Индикаторы фекального загрязнения (представители микрофлоры кишечника человека и животных);

          • Индикаторы воздушно-капельного загрязнения (комменсалы верхних дыхательных путей);

          • Индикаторы процессов самоочищения (обитатели внешней среды).

          

В состав первой группы СПМО входят:

• БГКП (бактерии группы кишечных палочек);

• энтерококки;

• протей;

• сульфитредуцирующие клостридии;

• термофилы, бактериофаги кишечные, сальмонеллы;

• бактероиды, бифидо- и лактобактерии;

• синегнойная палочка;

• кандида;

• ацинетобактер.

В состав второй группы входят стрептококки и стафилококки.

В третью группу входят:

• протеолиты;

• аммонификаторы и нитрификаторы;

• аэромоносы и бделловибрионы;

• споровые микроорганизмы;

• грибы и актиномицеты;

• целлюлозобактерии.

Тump – минимальное количество субстрата (в кубических сантиметрах или граммах), в котором ещё обнаруживают СПМО.

Индекс – количество СПМО, которое содержится в 1 л воды или в 1см³другого субстрата.

Общее микробное число и методы его определения

Общее микробное число (ОМЧ) – число всех микроорганизмов в 1 мл или в 1 г субстрата.

При этом учитывают, что чем боль­ше микроорганизмов обнаружено во внешней среде, тем вероятнее загрязнение патогенными микроорганизмами. В связи с этим ОМЧ даёт представление об эпидемиологической обстановке.

Существуют три метода определения ОМЧ.

1. Оптический метод прямого подсчёта бактерий под микроскопом в камере Горяева.

2. Бактериологический метод (менее точный).

3. Измерение биомассы.

Оптический метод обычно используют на водопроводных станциях при оценке эффективности работы очистных сооружений, но он не позволяет отличить живые бактерии от мёртвых. Исследование можно выполнить в течение 1 ч, поэтому метод незаменим в аварийных ситуациях. Метод позволяет судить о состоянии процессов самоочищения воды. В начальной стадии процесса самоочищения грамотрицательных бактерий больше, чем грамположительных, а палочковидных форм больше, чем кокковых. На завершающей стадии соотношение меняется на обратное.

Бактериологическим методом выявляют определённую физиологи­ческую группу бактерий, растущих при данных условиях. Например, обнаружение вегетативных форм микроорганизмов в прошедшем термическую обработку пищевом продукте свидетельствует о пов­торном заражении продукта после термической обработки или же о неэффективности последней. Обнаружение спор подтверждает удов­летворительное качество термической обработки.

Измерение биомассы осуществимо только в специализированных лабораториях путём взвешивания остатков бактериальной массы, определения показателей клеточного обмена и др. В практике этот метод не применяют.

ОМЧ определяют в следующих случаях:

• контроль качества очистки воды (в том числе колодезной);

• проверка эффективности мойки посуды;

• контроль чистоты воздуха в закрытых помещениях;

• определение свежести скоропортящихся продуктов;

• выбор места для строительства жилых объектов (исследование почвы);

• определение характера микрофлоры

Методы обнаружения микроорганизмов в воде.

Для обнаружения микроорга­низмом в воде и других биосубстратах и определения их количества могут быть использованы бактериологический имикроскопический методы.

Основные этапы бактериологического исследования: гомогенизация образца, десорбция микроорганизмов с плотных частиц, приготовле­ние разведений, посев на питательные среды, идентификация выде­ленных культур.

Гомогенизацию образца проводят для равномерного распределения бактерий в анализируемом объекте. При исследовании жидких, плот­ных, сыпучих продуктов, в зависимости от характеристик испытуе­мого материала, используют перемешивание простым встряхиванием или специальные приборы.

Десорбция бактерий с плотных частиц необходима для анализа объектов твёрдой консистенции. Для этого материал суспензируют в жидкости или с поверхности объекта берут смывы и отпечатки. При суспензировании к навеске образца массой 10 г добавляют 90 см³воды и интенсивно перемешивают (вручную или в гомогенизаторе). В даль­нейшем условно принимают 1 см³полученной суспензии эквивалент­ным 0,1 г исходного материала.

Общие колиформные бактерии– грамотрицательные, оксидазонегативные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре +37 °С в течение 24-48 ч.

Термотолерантные колиформные бактерии– входят в состав ОКБ и обладают всеми их признаками, но ферментируют лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре +44 °С в течение 24 ч.

Сульфитредуцирующие клостридии спорообразующие анаэроб­ные палочковидные микроорганизмы, восстанавливающие сульфит натрия в условиях культивирования на железо-сульфитном агаре при температуре 44 °С в течение 16-18 ч.

Коли-фаги – бактериальные вирусы, способные лизироватьЕ. coli и формировать при температуре 37 °С через 18 ч зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре.

Санитарно-показательные микроорганизмы, характеризующие загрязнение почвы.

Общее количество бактерийколичество микроорганизмов, образующих колонии на МПА при температуре 37 °С в течение 24 ч,суммарный показатель микробиологического загрязнения почвы микрофлорой преимущественно фекального происхождения.

Термофильные микроорганизмымикроорганизмы, образующие колонии на МПА при температуре 60 °С в течение 24 ч,показатель загрязнения почвы компостом или навозом. Почвы, показывающие высокое содержание кишечных палочек и низкоетермофилов, считают фекально загрязнёнными.

БГКП грамотрицательные не образующие спор короткие палочки, ферментирующие лактозу и глюкозу до кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24-48 ч, не обладающие оксидазной активностью.

Перфрингенс-титртитр грамположительных облигатно-анаэробных спорообразующих палочек, восстанавливающих сульфиты. ПрисутствиеClostridium perfringens(споровых форм) свидетельствует о давнем фекальном загрязнении.

Аммонификаторымикроорганизмы, превращающие азот в катионы аммония. Аммонификация (гниение) белковрезультат деятельности гнилостной микробиоты (актиномицеты, грибы, анаэробные бациллы). Высокое содержание в почве этой микробиоты свидетельствует о присутствии органических веществ.

Нитрификаторымикроорганизмы, окисляющие азот из солей аммония в нитраты и нитриты. К этой группе относятся представители родовNitrosococcus, Nitrosolobus, Nitrosobacter. Их присутствие свидетельствует о наличии органического загрязнения и активно идущих процессах самоочищения.

Аэробные целлюлозоразрушающие микроорганизмыпочвенная микробиота, использующая целлюлозу в качестве источника углерода. В этой группе велика роль неспоровых бактерий, базидиальных, дрожжеподобных и несовершенных грибов.

Общая численность сапрофитовколичество микроорганизмов образующих колонии на МПА при температуре 28-30 °С в течение 72 ч. Высокая численность сапрофитной микробиоты свидетельствует об органическом загрязнении почвы.

Патогенные микроорганизмысальмонеллы (Salmonella spp.), патогенные клостридии (С. tetani, С. botulinum), возбудитель сибирской язвы (Bacillus anthracis), вирусы.

З А Н Я Т И Е 11

Дата ______________

Тема: Санитарно-бактериологическое исследование воды, воздуха, почвы (2 день). Исследование кала на дисбактериоз (разбор схемы).

План занятия:

1. Знакомство с микрофлорой человеческого тела. Регистрация результатов посева отпечатков пальцев и слизи из зева.

2. Провести регистрацию результатов посева воздуха седиментационным методом Р. Коха.

3. Исследование кала на дисбактериоз (разбор схемы).

Методические указания

1. Сосчитать количество колоний, выросших на МПА и среде Эндо из посевов отпечатков пальцев, особо обратив внимание на колонии кишечной палочки на среде Эндо. Промикроскопировать при ок­раске по Граму несколько колоний со среды Эндо и МПА.

Промикроскопировать колонии, выросшие при посеве слизи из зева (окраска по Граму). Результаты работы оформить в виде протокола.

Протокол исследования микрофлоры пальцев рук

Питательная среда, использованная для культивирования бактерий	Число выросших колоний
МПА
Эндо (колонии кишечной палочки)

Окраска по Граму
Микрофлора пальцев руки	Исследуемая культура на кровяном МПА _____________________	Микрофлора слизи из зева

Протокол исследования выросшей микрофлоры слизистой оболочки зева

Питательная среда, использованная для культивирования бактерий	Количество колоний или степень интенсивности роста	Морфологические названия бактерий и их отношение к окраске по Граму
На МПА
На кровяном МПА

2.Провести подсчет выросших колоний из воздуха седиментационным методом Коха, используя формулу Омелянского. Полученные результаты зарегистрировать в рабочей тетради, промикроскопировать при ок­раске по Граму несколько колоний, зарисовать и заполнить протокол исследования отдельной колонии.

Расчет по модифицированной формуле Омелянского ведется на 1 м²поверхности:

X=n^.10⁴/^.r^2.t= _______________________________________________________________

где X- ОМЧ воздуха обследуемого помещения (КОЕ);п -количество колоний на чашке (КОЕ);t -время экспозиции чашки (мин); ^.r^{2 -}площадь чашки Петри (см²); 10⁴- пересчет м²в см².

Выросшие колонии микроорганизмов из воздуха на чашке Петри	Исследуемая культура (окраска по Граму) __________________________________

Протокол исследования колонии.

1.Размер колонии_______________________________________

2.Форма колонии_______________________________________

3. Поверхность колонии_________________________________

4. Края колонии________________________________________

5.Прозрачность колоний_________________________________

6.Пигмент_____________________________________________

7.Консистенция________________________________________

8.Форма бактерий______________________________________

9. Взаиморасположение бактерий_________________________

10.Латинское морфологическое название бактерий__________

3.Для бактериологического исследования используются свежие фекалии, со­бираемые в стерильную посуду (пробирки или пенициллиновые фла­коны) без консерванта. Материал должен быть исследован в течение 2 часов с момента дефекации.

Существует несколько методов исследования микрофлоры ки­шечника, большинство из которых сводится к количественному ис­следованию предварительно взвешенной навески фекалий.

Взвешивание проводится на стерильной пергаментной бумаге (навеска должна быть в пределах 0,5-1,0 г.), которая затем помещается в фарфоровую ступ­ку и заливается таким количеством фосфатно-тиогликолевого буфе­ра, чтобы получилось соотношение 1:10. Содержимое ступки тщательно растирается и отстаивается в течение 10 мин для оседания плотных частиц. Затем 0,5 мл содержимого из ступки переносится в пробирку с 4,5 мл фосфатно-тиогликолевого буфера и тщательно перемешива­ется. В дальнейшем материал последовательно раститровывается по 0,5 мл в 6-ти пробирках (получаются десятикратные разведе­ния). Из 6-й пробирки материал в количестве 0,1 мл переносится в пробирку с 9,9 мл буфера, а из неё 0,1 в следующую пробирку с аналогичным количеством буфера. Таким образом, в ступке содержится разведение материала 10^-1, а в последней пробирке – 10^-11. Посев целесообразно начинать с разведения 10^-11, исполь­зуя концевую пипетку на 1,0 мл.

Для выделения бифидобактерий по 0,1 и 1,0 мл из разведе­ний 10^-11, 10^-9и 10^-7засевают в пробирки с регенерированной средой Блаурокка; при этом получается 6 пробирок с разведения­ми от 10^-7до 10^-12.

Для выделения бактероидов по 0,1 мл из этих же разведений материала засевают на КАБ (кровяной агар бактероидов) с неомицином и культивируют по модифицированному методу Фортнера: площадь посева закрывают преципитационными (малого диаметра) чашками, создавая стро­го анаэробные условия, необходимые для культивирования бакте­роидов.

По 0,1 мл разведений 10^-7, 10^-6и 10^-5засевают на молочно-растительную среду /МРС/ - для выделения лактобацилл. Из разведений 10^-6и 10^-5делают посев по 0,1 мл на среду Эндо - для изоляции энтеробактерий; 0,1 мл из разведения 10^-6засе­вают на кровяной агар - для выявления гемолитической активности аэробной микрофлоры.

Для выявления энтерококков используют среду Калины, засе­вая по 0,1 мл из разведений 10^-6и 10^-5.

По 0,1 мл из разведения 10^-4засевают на чашечную среду Симмонса, позволяющую изолировать наиболее часто встречаемые УПЭ (представителя рода Цитробактер и трибы Клебсиелла) и на желточно-солевой агар - для выделения стафиллококков.

0,1 мл из разведения 10^-3засевают на среду Сабуро с полимиксином - для выделения дрожжей и дрожжеподобных грибов. Для выделения клостридий по 0,1 мл из разведений 10^-3и 10^-4засевают на среду Вильсон-Блера.

Все посевы инкубируют в термостате при 37 °С.

На второй день исследования:

1. Производят учёт роста на среде Эндо. Подсчитывают общее число, выросших колоний кишечных палочек, обращая внимание на их характер (цвет, наличие металлического блеска, диссоциацию, формы с пониженной ферментативной активностью). При обнаруже­нии лактозоотрицательных колоний анализ ведут как при выявле­нии патогенных представителей семейства энтеробактерий.

2. Кровяной, желточно-солевой агар и среду Сабуро извлекают из термостата и оставляют для дальнейшей инкубации при комнатной температуре, а желточно-солевой агар - при действии рассеянного света - для лучшего выявления пигментообразования.

На третий день исследования:

1. Производят учёт роста УПЭ на среде Симмонса. Помимо УПЭ (представителей родов Цитробактер, Энтеробактер, Клебсиелла, Гафния, наиболее часто выделяемых из фекалий, а также Про­виденсия, изолируемых из этого материала реже), дающих белые или окрашенные в цвет среды мелкие и средней величины слизистые или сухие колонии, часто в R-форме, изменяющие (в случае ути­лизации цитрата натрия) цвет среды до синего или не изменяю­щие его, вырастают кишечные палочки, в том числе и с пониженной ферментативной активностью, в виде очень мелких, прозрачных, зеленовато-белых колоний. Подсчитывают общее число колоний УПЭ, выросших на среде Симмонса, - делая перерасчёт на 1 г. В случае роста на чашке колоний УПЭ нескольких типов ведут подсчёт каж­дого из них и соответствующий пересчёт на 1 г фекалий.

Для идентификации УПЭ производят посев части изучаемой колонии на скошенный МПА, а другой части - на среду Кларка.

2. Учитывают количество колоний стафилококка, подтверж­дённого изучением морфологии в окрашенном по Граму мазке, на желточно-солевом агаре, делают пересчёт на 1 г, определяют пигментообразование и образование лецитиназы (лецитовителлазы), производят отсев колонии для выделения чистой культуры и даль­нейшего определения вида стафилококка.

3. Производят подсчёт числа колоний энтерококка на среде Калины (с пересчётом на 1 г), определяют наличие или отсутствие протеолитической активности.

4. На кровяном агаре отмечают наличие или отсутствие ге­молиза, в положительном случае определяют морфологию микроор­ганизма; подсчитывают % гемолитических форм к общему количест­ву выросших на этой среде колоний.

5. Отмечают наличие чёрных колоний на среде Вильсон-Блера, подсчитывают их общее количество (с переводом на 1 г), подт­верждают принадлежность выросших микроорганизмов к клостридиям изучением морфологии в окрашенном по Граму мазке. Нередко на этой среде вырастают, представители рода Протеус и Цитробактер, давая колонии, схожие с колониями клостридий.

6. Регистрируют рост на среде Сабуро с полимиксином, где вырастают дрожжи и дрожжеподобные грибы, давая белые средней величины и крупные колонии. Морфологию микроорганизмов подт­верждают микроскопией окрашенных по Граму препаратов. Опреде­ляют общее количество выросших колоний, делают пересчёт на 1 г, а для дифференциации дрожжей от дрожжеподобных грибов рода Кандида, делают посев на картофельный или крахмальный агар (для определения филаментации, характерной для грибов рода Кандида и отсутствующей у дрожжей).

На четвёртый день исследования:

I. Учитывают рост бифидобактерий на среде Блаурокка. Для этого из каждой пробирки с ростом готовят мазки, окраши­вают по Граму и микроскопируют. При микроскопии препаратов от­мечается характерная для бифидобактерий морфология и расположение. Учитывают предельное разведение материала, в котором ещё регистрируется рост бифидобактерий, подтверждённый нахож­дением этих микроорганизмов в окрашенных по Граму препаратах. При этом, не допуская большую ошибку, можно перевести предель­ное разведение материала на количество бифидобактерий в 1 г фекалий. Допустим, предельным разведением материала, в котором зарегистрирован рост бифидобактерий, подтверждённый изуче­нием морфологии в мазке, было 10^-10. С большой долей вероятнос­ти можно считать, что количество бифидобактерий в 1 г фекалий соответствует 10¹⁰(этот пересчёт необходим для дальнейше­го определения соотношения бифидобактерий и других микроорга­низмов).

2. Регистрируют рост лактобацилл на МРС, подсчитывают об­щее число колоний этих микроорганизмов, приводят к 1 г. Лактобациллы на МРС растут в виде мелких беловато-серых с ров­ными краями или более крупных желтовато-серых с изведенными краями колоний, дифференцировать которые от колоний других микроорганизмов не предоставляет особого труда. Лактобациллы до­вольно хорошо растут на среде Сабуро с полимиксином.

3. Производят учёт бактероидов на КАБах. На этой среде указанные микроорганизмы растут в виде мелких беловато-серых колоний; в мазке - это грамоотрицательные мелкие палочки, рас­положенные без особого порядка. Делают пересчёт для определе­ния количества бактероидов в 1 г фекалий. Для дифференциации бактероидов от лактобацилл, спорообразующих бактерий и др. микроорганизмов производят посев части колонии на КАБ с после­дующим культивированием в аэробных условиях, а также окраску, на выявление спор.

4. Повторно учитывают рост грибов рода Кандида на среде Сабуро с полимиксином (при отсутствии роста на этой среде че­рез 24-48 часов); при наличии роста, производят изучение как в п.6 третьего дня исследования.

5. Для идентификации УПЭ производят посев чистой культу­ры со скошенного МПА на среды с аминокислотами (лизином, аргинином, орнитином).

На пятый день исследования:

1. Производят учёт филаментации (если предварительно бы­ли подозрительные колонии на среде Сабуро).

2. Учитывают тесты, дифференцирующие бактероиды от лакто­бацилл и аэробов (по отсутствию роста на МРС и на КАБах в аэ­робных условиях).

3. Для идентификации УПЭ производят учёт изменений со сред с аминокислотами, а также результатов реакции Фогес-Проскауэра и с метиловым красным, что в ряде случаев даст возможность ус­тановить род и вид; в том случае, когда идентификацию по ука­занным тестам провести не удаётся, проводят посев на дополни­тельные углеводы.

4. Выдача ответа.

В ответе следует указать количество анаэробов (бифидобак­терий, бактероидов, лактобацилл), а также количество аэробных микроорганизмов различных родов, изолированных из 1г фекалий.

В заключении следует указать на отсутствие или наличие дисбактериоза кишечника и степень его выраженности.

Основой для заключения должно быть соотношение количества бифидобактерий (как основных представителей анаэробной группы бактерий, выполняющих наиболее важную для организма физиологи­ческую функцию) и аэробов.

При установлении пограничных состояний между нормой и па­тологией очень важным показателем является соотношение между бифидобактериями и E.coli.

Для его установления количество бифидобактерий, определён­ных в конкретном образце, подтверждённых изучением морфологии в окрашенных по Граму препаратах, принимают за 100 %, а количество E. coliза Х. Составляют пропорцию и высчитывают значение X.

Например, количество бифидобактерий в I г = 10¹⁰, а коли­чествоE. coli= 700 млн.

Составляем пропорцию:

10¹⁰ ------ 100 %

700 млн ----- X

X = 7 %

Данный показатель превышает норму (5 %) и свидетельствует о начальных сдвигах в микрофлоре (нарушение соотношения между бифидобактериями и E. coli), что может быть определено как дисбактериоз I степени. Однако такие расчёты следует проводить не во всех случаях, а только тогда, когда имеются затруднения в диф­ференциации дисбактериоза I степени и эубиоза.

Приложение к ЗАНЯТИЮ 11

Количественный и качественный состав микрофлоры кишечника в норме

Названия микроорганизмов	Дети до 1 года	Дети старшего возраста	Взрослые
Бифидобактерии	10^10– 10^11	10^9– 10^10	10^8– 10^10
Лактобактерии	10^6– 10^7	10^7– 10^8	10^6– 10^8
Эшерихии	10^6– 10^7	10^7– 10^8	10^6– 10^8
Бактероиды	10^7– 10^8	10^7– 10^8	10^7– 10^8
Пептострептококки	10^3– 10^5	10^5– 10^6	10^5– 10^6
Энтерококки	10^5– 10^7	10^5– 10^8	10^5– 10^8
Сапрофитные стафилококки	≤10^4	≤10^4	≤10^4
Патогенные стафилококки	-	-	-
Клостридии	≤10^3	≤10^5	≤10^5
Кандида	≤10^3	≤10^4	≤10^4
Патогенные энтеробактерии	-	-	-

З А Н Я Т И Е 12

Дата ______________

Тема: Санитарно-микробиологическое исследование пищевых продуктов (разбор схемы). Бактериологический контроль качества стерилизации и дезинфекции.

План занятия:

1. Проведение санитарно-микробиологического исследования пищевых продуктов на наличие санитарно-показательных микроорганизмов.

а) определение количества бактерий группы кишечных палочек;

б) методы обнаружения сальмонелл;

в) методы выявления и определения количества Staphylococcus aureusв колбасных изделиях.

2. Исследование пищевых продуктов на наличие возбудителей пищевых токсикоинфекций: посев на среды обогащения и дифференциально-диагностические среды.

3. Изучение морфологических и тинкториальных свойств сальмонелл и кишечной палочки.

4. Методика посева смывов на общую бактериальную обсемененность.

5. Метод отпечатков на «Бактотест» со средой Эндо при санитарно-бактериологическом контроле на объектах питания.

Методические указания

1.а) Приопределении количества бактерий группы кишечных палочекнавеску анализируемого продукта (1,00,001 г по СанПиН 2.3.2.1078-01), в которой не должно быть БГКП, смешивают с 9 частями жидкой питательной среды (чаще всего используют среду Кесслер, содержащую в своём составе генцианвиолет, угнетающий рост грамположительных бактерий). Из пробирок с забро­дившей средой (помутнение, наличие газа в поплавках) делают посевы на чашки со средой Эндо. Посевы выдерживают в термостате при темпера­туре 37 °С в течение 18-24 ч. Из колоний, типичных для БГКП (красных, с металлическим блеском, розовых, бледно-розовых), готовят мазки и окрашивают их по Граму.

б) Методы обнаружения сальмонелл. Пробу мяса или мясного продукта дважды пропускают через мясорубку, перемешивают, взвешивают 25 г, затем помещают в стерильную банку смесителя с 225 см³буферной пептонной водой и гомогенизируют. Далее в асептических условиях переносят содержимое смесительной банки в стерильную колбу вместимостью 500 см³. Колбу выдерживают в термостате при температуре (37±1) °С не менее 16 и не более 20 ч, после чего приступают к анализу.

Выявление сальмонелл проводится в четыре последовательных этапа: первичный (прямой) посев, обогащение, посев со среды обогащения и подтверждение.

Первичный посев производится путем посева взвеси исследуемого материала на плотные элективные среды. Эти среды выдерживают в термостате при температуре 37 °С и исследуют на присутствие колоний, которые являются типичными или подозрительными на сальмонеллы.

На элективных средах сальмонеллы растут, образуя характерные колонии:

• на фуксин-сульфитном агаре (агаре Эндо) сальмонеллы растут в виде круглых, бесцветных или слегка розоватых прозрачных, или полупрозрачных колоний;

• на эозин-метиленовом синем агаре (агаре Левина) сальмонеллы растут в виде прозрачных, бледных, нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний.

Обогащение проводят путем посева на жидкие селективные среды (среды Мюллера, Кауфмана и Киллиана, селенитовый Ф-бульона и хлористо-магниевая среды "М"). Эти среды выдерживают в термостате при температуре 37 °С. На селенитовом бульоне лучшей температурой для накопления сальмонелл является 43 °С.

В случае отсутствия роста бактерий сальмонелл при первичном (прямом) посеве на элективных средах, через 12-24 ч проводят высев на селективные среды со сред обогащения. Предварительно содержимое флаконов перед пересевом тщательно перемешивают и высевают штрихом петлей диаметром 2,5-3 мм на чашку с висмут-сульфитным агаром, бактоагаром Плоскирева или агаром Эндо. Посевы помещают в термостат на 18-24 ч при температуре 37 °С, а посевы на висмут-сульфитном агаре на 48 ч.

На селективных средах сальмонеллы растут, образуя характерные колонии:

• на бактоагаре Плоскирева сальмонеллы растут в виде бесцветных колоний, но колонии более плотные и несколько меньшего размера, чем на среде Эндо;

• на висмут-сульфитном агаре сальмонеллы растут в виде черных или коричневых колоний с характерным металлическим блеском.

Далее проводят подтверждение пересев подозрительных на сальмонеллы колоний и определение их биохимических и серологических характеристик. В соответствии с нормативами санитарно-биологических показателей для мяса и мясных продуктов содержание сальмонелл в 25 г исследованного продукта не допустимо.

в) Методы выявления и определения количества Staphylococcus aureus в колбасных изделиях и продуктах из мяса.

Сущность метода заключается в определении морфологии, характера роста на питательных средах и в способности отдельных стафилококков продуцировать лецитиназу и коагулировать цитратную плазму крови кролика под воздействием фермента коагулазы.

Методика проведения анализа заключается в следующем. Из разведения анализируемой взвеси продукта (1:10) проводят посевы на молочно-солевой агар, содержащий 65 г/дм³хлористого натрия, для выявления пигмента или желточно-солевой агар, содержащий 65 г/дм³хлористого натрия, для выявления лецитиназной активности. Взвесь наносят на поверхность агара в количестве 0,2 см³и равномерно растирают по всей поверхности агаровой среды. Посевы термостатируют в течение 24 ч при температуре 37 °С и 24 ч выдерживают при комнатной температуре.

На поверхности питательной среды колонии стафилококка имеют вид плоских или слегка выпуклых блестящих колоний с ровным краем. При этом на молочно-солевом агаре лучше выявляется пигмент (эмалево-белый или золотистый), а на желточно-солевом агаре колонии стафилококков могут образовывать «радужный венчик», что является одним из признаков их патогенности.

Из подозрительных колоний готовят препараты, которые окрашивают по Граму. При наличии стафилококков в препарате обнаруживаются грамположительные мелкие кокки, располагающиеся неправильными гроздьями.

Для подтверждения признаков патогенности стафилококков ставят реакцию плазмокоагуляции. В прибор с 0,5 см³ цитратной плазмы крови кролика, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:4, вносят петлю чистой суточной культуры стафилококка и ставят в термостат при температуре 37 °С. Реакцию плазмокоагуляции учитывают через 3-4 ч (не встряхивая пробирку) и оставляют в термостате на сутки для окончательного учета через 24 ч.

Тест на коагулазу считают положительным, если культура показала, по крайней мере, 3+ оценку коагулазной реакции, отмеченной на рисунке 1. Реакцию на 1+ или 2+ оценивают как промежуточную.

INCLUDEPICTURE "http://docs.cntd.ru/picture/get?id=P0173&doc_id=1200098769&size=small" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://docs.cntd.ru/picture/get?id=P0173&doc_id=1200098769&size=small" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://docs.cntd.ru/picture/get?id=P0173&doc_id=1200098769&size=small" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://docs.cntd.ru/picture/get?id=P0173&doc_id=1200098769&size=small" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://docs.cntd.ru/picture/get?id=P0173&doc_id=1200098769&size=small" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://docs.cntd.ru/picture/get?id=P0173&doc_id=1200098769&size=small" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://docs.cntd.ru/picture/get?id=P0173&doc_id=1200098769&size=small" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://docs.cntd.ru/picture/get?id=P0173&doc_id=1200098769&size=small" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://docs.cntd.ru/picture/get?id=P0173&doc_id=1200098769&size=small" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://docs.cntd.ru/picture/get?id=P0173&doc_id=1200098769&size=small" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://docs.cntd.ru/picture/get?id=P0173&doc_id=1200098769&size=small" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://docs.cntd.ru/picture/get?id=P0173&doc_id=1200098769&size=small" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://docs.cntd.ru/picture/get?id=P0173&doc_id=1200098769&size=small" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://docs.cntd.ru/picture/get?id=P0173&doc_id=1200098769&size=small" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://docs.cntd.ru/picture/get?id=P0173&doc_id=1200098769&size=small" \* MERGEFORMATINET

Рис. 1. Результаты коагулазного теста

 отрицательная оценка: не отмечено образования фибрина;

1+ положительная оценка: небольшие несформировавшиеся комочки;

2+ положительная оценка: небольшой сформировавшийся комок;

3+ положительная оценка: большой сформировавшийся комок;

4+ все содержимое пробирки скоагулировано и не меняет своего положения при переворачивании пробирки.

Для определения количества стафилококков учитывают колонии стафилококков, давшие положительную реакцию плазмокоагуляции.

Количество S. aureusв 1 см³или 1 г продукта определяют исходя из количества коагулазоположительных стафилококков, принадлежность которых кS. aureus подтверждена по образованию ацетоина, определению ферментации в аэробных условиях мальтозы и, при необходимости, определению термостабильной нуклеазы и гемолитической активности. При расчете на 1 г продукта количество подсчитанных колоний умножают на степень разведения и делят на количество посевного материала.

2.Приготовить взвесь в физиологическом растворе кусочка пищевого продукта, зараженного сальмонеллами, и произвести посев взвеси на среду обогащения и на дифференциально-диагностическую среду Плоскирева или Эндо.

3.Приготовить препараты-мазки из культур сальмонелл и кишечной палочки, окрасить по Граму, промикроскопировать и сравнить морфологию бактерий во всех препаратах. Препараты зарисовать.

Salmonella enteritidis	Escherichia coli

4.Методика посева смывов на общую бактериальную обсемененность.

Общую бактериальную обсемененность определяют для установления эффективности санитарной обработки посуды в посудомоечных машинах, а также при оценке новых моющих и дезинфицирующих средств. Для этого перед посевом в пробирку с тампоном (смыв) добавляют 5 мл 0,1% пептонной воды или изотонического раствора хлорида натрия. Тампон тщательно отмывают, после чего 1,0 мл смывной жидкости помещают в чашку Петри и заливают расплавленным МПА. Чашки помещают в термостат при 30 °C. Предварительный подсчет выросших колоний производят через 48 часов, окончательный через 72 часа. Количество колоний, выросших на чашке, умножают на 10 для определения общего количества бактерий, содержащихся на поверхности исследуемого предмета.

5.Метод отпечатков на «Бактотест» со средой Эндо при санитарно-бактериологическом контроле на объектах питания.

Данный метод рекомендуется использовать для контроля эффективности санитарной обработки рабочих поверхностей, кухонного инвентаря, посуды, спецодежды и рук обслуживающего персонала.

«Бактотесты» представляют собой круглые ванночки площадью 10 см²с крышками, выпускаемые стерильными, упакованными по 24 штуки в герметизированные пеналы и предназначенные для разового использования. Перед началом исследования необходимо приготовить среду Эндо в соответствии с наставлением по ее применению, открыть пенал с «Бактотестами», вынуть их из пенала и снять крышки; расположить «Бактотесты» на горизонтальной поверхности; прокипяченную и слегка остуженную среду Эндо разлить по 2 мл в каждую ванночку; после застывания и охлаждения среды Эндо ванночки закрыть крышками и упаковать в пеналы. Подготовленные к работе «Бактотесты» можно хранить при комнатной температуре в течение 4-х суток в сухом и защищенном от света месте.

Взятие отпечатков проводят готовыми (заправленными) «Бактотестами» путем легкого прижатия средой Эндо к обследуемой поверхности. При этом на один «Бактотест» берут 10 отпечатков (обследуемая площадь 100 см²) с поверхности больших предметов: разделочные доски, столы, весы, кастрюли, котлы, разделочные ножи, разливные ложки, тарелки, спецодежда обслуживающего персонала; один «Бактотест» используют для обследования трех мелких предметов: стаканы, чашки, столовые и чайные ложки, вилки, столовые ножи; при обследовании рук обслуживающего персонала на один «Бактотест» делают отпечатки со всех пальцев. Использованные «Бактотесты» маркируют восковым карандашом и упаковывают в пенал, закрыв крышками. После взятия отпечатков проводят инкубацию «Бактотестов» со средой Эндо в термостате при 37 °С в течение 18-24 часов. Выросшие колонии, подозрительные на бактерии группы кишечной палочки по внешнему виду и по морфологии мазков, окрашенных по Граму, высевают на среду Гисса с глюкозой в пробирки с поплавками с последующей инкубацией в термостате при 37 °С в течение 18-24 часов. Заключение о наличии микробов группы кишечной палочки на обследованных объектах делается на основании образования кислоты и газа в пробирках со средой Гисса.

Контрольные вопросы

Как определяют количество БГКП?

Какие этапы выявления сальмонелл вы знаете?

Что такое элективные и селективные питательные среды?

Какие характерные колонии образуют сальмонеллы на элективных средах?

Какие среды обогащения вы знаете?

Какие характерные колонии образуют сальмонеллы на селективных средах?

Что является ведущим свойством при установлении патогенности стафилококков?

В чем сущность реакции плазмокоагуляции?

Как оцениваются результаты коагулазного теста?

Какие санитарно-показательные микроорганизмы продуктов питания вы знаете?

Как осуществляется санитарно-микробиологический контроль на объектах питания?

С помощью каких приспособлений производится взятие смывов?

Какие существуют рекомендации при взятии смывов?

В течение какого времени после взятия смывов следует проводить их анализ?

В чем заключается методика посева смывов на общую бактериальную обсемененность?

Как осуществляется санитарно-бактериологический контроль методом отпечатков?

Что представляет собой «Бактотест»?

В каких случаях проводятся санитарно-бактериологические исследования на объектах питания?

Что служит объектами санитарно-бактериологических обследований в местах общественного питания?

Какие микроорганизмы являются индикаторами санитарного неблагополучия на пищевых предприятиях?

Какие методы отбора проб с предметов обихода вы знаете?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 12.