1 22 138 174 345 471

N I II III IV C

H1 H1a H2 H3 H4

DnaG DnaA

Рис. 2.2. Схема организации функциональных областей ДНК-геликазы DnaB E. coli.

I – маленький N-концевой домен 12 кД, II – гибкий линкер, III+IV – большой С-концевой домен 33 кД, III – домен АТФазной активности, IV – домен взаимодействия с ДНК.

Н1, Н1а, Н2, Н3 и Н4 – консервативные домены геликаз семейства F-4. Указаны главные области взаимодействия с белком DnaА и праймазой DnaG

Только N-концевой домен DnaB изучен с высоким разрешением методами рентгеноструктурного анализа и ЯМР. 3-мерная структура всего белка пока установлена лишь методом криоэлектронной микроскопии с разрешением ~20 A. Эти данные показали, что в гексамере белка DnaB субъединицы образуют кольцо диаметром 12,5-14 нм и высотой 5,7 нм. Кольцо имеет центральное отверстие диаметром 3-4 нм, через которое может проийти нить онДНК. Аналогичные размеры имеют и кольца многих других гексамерных ДНК-геликаз. Существуют две взаимопревращающиеся формы кольца DnaB: “треугольник” с 3-кратной симметрией С₃ и “пропеллер” с 6-кратной симметрией С₆ (рис. 2.3). Взаимопревращение этих форм зависят от белок-белковых взаимодействий и, в частности, от способности N-концевых доменов I смежных субъединиц образовывать димеры. Домены I всех субъединиц расположены на одной и же поверхности основания кольца, а в самом кольце каждая из субъединиц взаимодействует только с 2 ближайшими соседями (рис. 2.4, А).

Структура комплексов белка DnaB с онДНК и вилочными субстратами ДНК изучена методом резонантного флуоресцентного переноса энергии. Эти данные показали, что онДНК действительно проходит через центральный канал гексамера DnaB, а не наматывается на её поверхности. Они позволили предложить модель связывания DnaB с ДНК в репликативной вилке (рис. 2.4, В). “Передняя” часть белка DnaB, обращенная в сторону расплетаемого дуплекса ДНК, образована большими С-концевыми областями всех 6 субъединиц, с которыми взаимодействует участок днДНК длиной не более 2-3 п.н. Две расплетенные нити ДНК на “переднем” краю разделяются друг от друга: 5’-нить попадает в центральный канал кольца DnaB, а 3’-нить “исключается” за пределы гексамера. Во внутреннем канале кольца DnaB

Рис. 2.3. Электронномикроскопические изображения двух гексамерных форм ДНК-геликазы DnaB E. coli: с 3-кратной (слева) и 6-кратной (справа) симметрией

Рис. 2.4. Модели гексамера геликазы DnaB E. coli.

А. Домены белка DnaB: 1- глобулярный N-концевой домен I, 2 – линкерный участок II, 3 – удлиненная С-концевая область доменов III и IV.

В. Предполагаемая структура комплекса белка DnaB с вилочным стыком в ДНК. Показано, как 3’-нить онДНК исключается из центрального канала гексамера, а 5’-нить связывается с одной из субъединиц в центральном канале.Стрелкой указано направление движения белка DnaB по ДНК

участок расположен участок 5’-нити длиной ~20 н., который, возможно, частично взаимодействует с канавкой в субъединице DnaB, находящейся в данный момент времени в активном состоянии со связанным АТФ (см. стр. 00). 5’-конец 5’-нити ДНК выходит из отверстия кольца через “заднюю” часть, образованную малыми N-концевыми доменами субъединиц DnaB, взаимодействующими с праймазой. Такая организация комплекса благоприятна для прямой передачи расплетенной 5’-нити в качестве матрицы для синтеза РНК-праймеров фрагментов Оказаки.