2.2. Белки, связывающие однонитевую днк

Однонитевые участки ДНК, появляющиеся в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК, могут быстро превращаться в нуклеопротеиновые комплексы, полностью покрываясь специальными белками, получившими название белков, связывающихся с онДНК (SSB – от single-stranded DNA binding proteins). Наиболее хорошо изученными представителями этого класса белков являются белок gp32 фага Т4, белок SSB E. coli и эукариотический белок репликации А (RPA, или фактор репликации RFA). Эти белки преимущественно и неспецифичным в отношении последовательности образом связываются с онДНК, откуда и произошло их название. Связывание белков SSB c онДНК, как правило, является кооперативным.

Название SSB является недостаточно корректным и четким, т.к. существуют многие другие белки, предпочитающие связываться с онДНК, но не относящиеся к SSB. Наиболее характерным примером является центральный белок гомологической рекомбинации RecA, связывающйся с онДНК с высоким сроством и образующий нуклеопротеиновые филаменты RecA. Альтернативным, но тоже неудачным , является название «белки, дестабилизирующие двойную спираль ДНК». Действительно, в присутствии белков SSB могут устраняться двунитевые шпильки в онДНК. Однако, в отличие от ДНК-геликаз, белки SSB сами не способны вызывать активное расплетание нитей днДНК. Вероятно, наиболее правильным названием SSB было бы «белки, стабилизирующие онДНК», но оно не смогло вытеснить привычный термин SSB.

Стабилизация онДНК является первым общим свойством всех белков SSB, которые защищают онДНК от деградации под действием вездесущих “однонитевых” нуклеаз. Вторым общим признаком белков SSB является стимуляция синтеза ДНК. В присутствии белков SSB скорость и точность синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразами, могут возрастать в десятки раз. Эту функцию белков SSB мы рассмотрим более детально в главе 3. И, наконец, по крайней мере некоторые белки класса SSB стимулируют гомологическую рекомбинацию. Так, у E. coli белок SSB стимулирует опосредованные белком RecA стадии образования составных молекул и переноса нитей ДНК. В репликации, репарации и рекомбинации белки SSB функционируют в стехиометрических, а не каталитических количествах по отношению к доступной онДНК и не обладают ферментативной активностью.

Белок gp32 фага Т4, кодируемый геном 32, играет важную роль в метаболизме фаговой ДНК. Заражение при непермиссивной температуре клеток E. coli мутантом фага Т4, температурочувствительным по гену 32, сопровождается очень быстрой остановкой репликации фаговой ДНК и образованием её фрагментов. Кроме того, в отсутствие белка gp32 не образуются составные молекулы фаговой ДНК в процессе рекоомбинации, от которой зависит поздняя стадия репликации ДНК Т4. В зараженных фагом Т4 культурах E. coli белок gp32 присутствует в количестве до 10000 молекул на клетку. Белок gp32 имеет длину 301 остаток (мол. м. 33,5 кД) и в разбавленных растворах in vitro находится в форме мономера. Эта форма gp32 может связываться с онДНК. Молекула gp32 состоит из 3 доменов (рис. 2.12, А), обнаруженных методом ограниченного протеолиза. Удаление первых 17 остатков на N-конце gp32 и некоторые замены основных аминокислотных остатков лиз₃ или арг₄ полностью устраняют кооперативные взаимодействия между молекулами gp32, связаннымис онДНК. Эти мутации нарушают также функции gp32 в процессах репликации и репарации ДНК фага Т4. Последние 46 остатков на С-конце gp32 участвуют во взаимодействиях с другими белками аппарата репликации и рекомбинации фага Т4, например, с фаговыми ДНК-полимеразой gp43 и праймазой gp61 и белками рекомбинации UvsX и UvsY. Центральный домен gp32 (остатки 21-254) предсталяет собой домен связыввания с онДНК, который включает субдомен связывания катиона Zn²⁺, существенного для конформационной стабильности gp32. Изолированный центральный домен связывается с онДНК с таким же сродством, как и целый белок gp32.

А.