- •Калинин Виталий Леонидович. Репликация генома
- •Классификация днк-полимераз
- •Днк-полимеразы e. Coli
- •1.2.1. Днк-полимераза I e.Coli
- •1.2.2. Днк-полимераза II e.Coli
- •1.2.3. Днк-полимераза III e. Coli
- •1.3. Эукариотические днк-полимеразы и днк-полимеразы археев
- •1.3.1. Днк-полимераза
- •Главные эукариотические днк-полимеразы
- •1.3.2. Днк-полимераза
- •1.3.3. Днк-полимераза
- •1.3.4. Днк-полимеразы и
- •1.3.5. Днк-полимеразы археев
- •1.4. Скользящие зажимы днк-полимераз и их погрузчики
- •1.4.1. Скользящие зажимы – факторы процессивности днк-полимераз
- •1.4.2. Погрузчики скользящего зажима
- •Литература
- •Глава 2. Вспомогательные белки репликации днк
- •2.1. Днк-геликазы
- •2.1.1. Общая характеристика геликаз
- •5’3’ 3’5’
- •3’ 5’
- •1 22 138 174 345 471
- •2.1.3. Днк-геликаза репликативной вилки у эукариотов
- •2.1.4. Механизм действия гексамерных днк-геликаз
- •1 10 70 245
- •2.2. Белки, связывающие однонитевую днк
- •1 21 254 301
- •Домены dвр-а - dвр-d белка rpAизображены в виде ладоней, а онДнк – в виде стрелки
- •2.3. Праймазы
- •1 100 200 300 400 500 582
- •1 2 3 4 5 6
- •2.4. Днк-лигазы
- •2.5. Днк-топоизомеразы
- •Литература
- •Глава 3. Инициация репликации хромосомной днк
- •3.1. Инициация репликации хромосомы e. Coli
- •3.1.1. Белок-инициатор DnaA
- •1 56 129 350 429
- •Ihf r5(m)
- •3.1.3. Этапы инициации репликации на онр oriC
- •3.1.4. Регуляция инициации репликации хромосомы e. Coli
- •Секвестрирование oriC
- •3.2. Инициация репликации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
- •3.2.1. Области начала репликации (онр) ars и комплекс узнавания онр (orc)
- •Gaaaagcaagcataaaagatctaaacataaaa tctgtaaaataaca
- •Изогнутыми стрелками отмечены сайты инициации двунаправленной репликации хромосомной днк. Приведена последовательность комплементарной нити сайта acs
- •3.2.2. Этапы пути инициации репликации на онр у дрожжей
- •3.3. Инициация репликации у высших эукариотов
- •3.3.1. Белковые компоненты и путь инициации репликации
- •3.3.2. Проблема существования областей начала репликации у высших эукариотов
- •90 40 60 165 330 65 190 (П.Н.)
- •17 5 23 (Т.П.Н.)
- •55 Т.П.Н.
- •Caaaagcaagacaaa gacaagc tccaaataagattca Ori хомячка (cho)
- •3.4. Регуляция инициации репликации в эукариотических клетках
- •Литература
Ihf r5(m)
gatcagaatgaggggttatacacaactcaaaaactgaacaacagttgttctttggataact
ctagtctttctccccaatatgtgttgagtttttgacttgttgtcaacaagAaACCTATTga
R2 Fis R3
accggttgatccaagcttcctgacagagttatccacagtagatcgcac
tggccaactaggttcgaaggactgtctcaataggtgccatctagcgtg
R4
Рис. 3.2. Минимальная область начала репликации oriC E. coli.
Вертикальными линиями отмечены границы минимальной области ori. Cайты GATC изображены прописными буквами, а блоки DnaA (R1-R5) -подчеркутыми прописными буквами и указана их ориентациия (строчными буквами в этих блоках отмечены отклонения от консенсусной последовательности 5'-ТТАТССАСА). Курсивом с подчеркиванием обозначены сайты связывания белков IHF и Fis. Двусторонние стрелки отмечают положения АТ-богатых областей (АТ-участка и 13-меров L, M и R). Подчеркнутыми жирными буквами набраны сайты связывания DnaA-АТФ и стрелками указана их ориентация
3.1.3. Этапы инициации репликации на онр oriC
Для инициации репликации в ОНР oriC необходимо, чтобы матрица ДНК находилась в сверхскрученной кольцевой форме. Первой стадией инициации является образование начального “преинициирующего” комплекса, в котором белок DnaA в мономерной форме связывается с 4 более сильными из 5 блоков DnaA (R1-R4). Связывание DnaA вызывает изгибание ДНК на 40о в каждом из этих блоков (рис. 3.3). Первичный комплекс содержит также белок Fis, ассоциированный с узнаваемым им сайтом рядом с нонамером R2. Дальнейшая сборка комплекса инициации требует кооперативной мультимеризации многих молекул белка DnaA. Предполагается, что Fis ингибирует продвижение инициации до тех пор, пока на oriC не соберется достаточный набор молекул DnaA.
Рис. 3.3. Цикл инициации репликации хромосомы E. coli
После этого белок Fis покидает область oriC, белок DnaA прочно связывается со слабым сайтом R3, и в комплекс входит фактор IHF, который вызывает очень сильное изгибание ДНК. Такой же эффект достигается в отсутствие IHF при более высокой концентрации DnaA. В результате образуется искривленный компактный нуклеопротеиновый комплекс ДНК oriC, содержащий около 20 молекул DnaA. В присутствии ещё одного гистоноподобного белка HU при высокой концентрации АТФ (более 20 мМ) и при физиологической температуре (37о) образуется “открытый” комплекс инициации, в котором расплетаются АТ-богатые области на левом фланге oriC. В этом процессе должна участвовать активная форма DnaA-АТФ, но гидролиз связанного АТФ не происходит, так что его энергия не используется для расплетания нитей ДНК. Возможно, причиной локального плавления ДНК являются напряжения, возникающие в нуклеопротеиновом комплексе с DnaA-АТФ. Расплетание начинается в правом 13-мере R, а затем распространяется на элементы L и М.
Следует учесть также, что в процессе расплетания ДНК участвуют дополнительные сайты связывания белка DnaA в АТ-богатых участках ДНК, названные пентамерными блоками DnaA-АТФ и имеющие консенсусную последовательность 5’-AGatct. Эти сайты имеют очень низкое сродство к DnaA-АТФ в днДНК и гораздо более высокое сродство в расплетенной онДНК. Высказано предположение, что вначале DnaA-АТФ связывается с высоким сродством с сайтом R1 в днДНК, и из этой якорной области начинается кооперативное связывание DnaA-АТФ с соседними пентамерными блоками. Это приводит к дестабилизации двойной спирали в АТ-богатой области 13-меров и её расплетанию. Разошедшиеся одиночные нити ДНК стабилизируются комплексом DnaA-АТФ, имеющим к ним высокое сродство. В момент начала расплетания с областью oriC связываются 18 мономеров DnaA-АТФ, но в открытом комплексе число связанных комплексов DnaA-АТФ увеличивается до 24-30 за счет взаимодействия с однонитевыми расплетенными участками. Расплавленная область вначале имеет длину 28 п.н., но затем онДНК покрывается белком SSB, и длина области денатурации ДНК увеличивается до 44-46 п.н.
Частичное плавление ОНР служит предпосылой для связывания ДНК-геликазы DnaВ, которая вербуется на свободную от белка SSB онДНК в составе комплекса с её погрузчиком DnaС (см. раздел 2.1). В вербовке этого двойного гексамера на oriC участвует сам связанный с ДНК белок DnaA, который взаимодействует N-концевым доменом I с центральной -областью DnaВ и центральным доменом III с N-концом DnaВ. Для погрузки геликазы DnaВ требуется почти весь белок DnaA, но связывание АТФ с DnaA не является обязательным.
С начальным однонитевым пузырьком ДНК длиной 44 н. связываются два гексамера DnaВ-DnaС и увеличивают его длину до 65 н. Гидролиз АТФ в этом комплексе вызывает освобождение DnaС и активацию геликазной активности DnaВ. В результате с расплавленным АТ-богатым участком oriC оказываются связанными два активных гексамерных DnaВ – по одному на 5’-стороне каждой из разошедшихся нитей ДНК. Это, вероятно, обусловлено существованием двух разнонаправленных триад сайтов связывания DnaA-АТФ в каждой из двух нитей и, в конечном итоге, приводит к сборке на ОНР oriC двух дивергентно ориентированных репликативных вилок. Два геликазных комплекса движутся по комплементарным нитям ДНК в направлении 5’3’ друг мимо друга и взаимодействуют с праймазой DnaG, которая синтезирует затравки РНК вначале для ведущих, а затем отстающих нитей двух разнонаправленных репликативных вилок (рис. 3.4). На праймированных сайтах собираются два скользящих зажима -субъединиц ДНК-полимеразы III и два димера ее каталитических -субъединиц. Таким образом, инициация репликации ДНК на oriC завершается образованием двух движущихся в противоположных направлениях репликативных вилок.
Рис. 3.4. Этапы образования двух разнонаправленных репликативных вилок при инициации репликации в области oriC хромосомы E.coli.
1 – связывание белка DnaA, 2 – связывание двойного гексамера DnaВ-DnaС, 3 – погрузка колец белка DnaВ и геликазы DnaG и синтез праймеров для ведущей и отстающей нитей двух репликативных вилок.
I – гексамер DnaВ, II – мономер DnaС, III – белок DnaА, IV - блоки DnaА, V – 13-меры, VI – праймеры для ведущей нити (для репликативных вилок, движущихся влево или вправо - на верхней и нижней матричных нитях соответственно), VII – праймеры для отстающей нити (для репликативных вилок, движущихся влево или вправо - на нижней и верхней матричных нитях соответственно).