- •Калинин Виталий Леонидович. Репликация генома
- •Классификация днк-полимераз
- •Днк-полимеразы e. Coli
- •1.2.1. Днк-полимераза I e.Coli
- •1.2.2. Днк-полимераза II e.Coli
- •1.2.3. Днк-полимераза III e. Coli
- •1.3. Эукариотические днк-полимеразы и днк-полимеразы археев
- •1.3.1. Днк-полимераза
- •Главные эукариотические днк-полимеразы
- •1.3.2. Днк-полимераза
- •1.3.3. Днк-полимераза
- •1.3.4. Днк-полимеразы и
- •1.3.5. Днк-полимеразы археев
- •1.4. Скользящие зажимы днк-полимераз и их погрузчики
- •1.4.1. Скользящие зажимы – факторы процессивности днк-полимераз
- •1.4.2. Погрузчики скользящего зажима
- •Литература
- •Глава 2. Вспомогательные белки репликации днк
- •2.1. Днк-геликазы
- •2.1.1. Общая характеристика геликаз
- •5’3’ 3’5’
- •3’ 5’
- •1 22 138 174 345 471
- •2.1.3. Днк-геликаза репликативной вилки у эукариотов
- •2.1.4. Механизм действия гексамерных днк-геликаз
- •1 10 70 245
- •2.2. Белки, связывающие однонитевую днк
- •1 21 254 301
- •Домены dвр-а - dвр-d белка rpAизображены в виде ладоней, а онДнк – в виде стрелки
- •2.3. Праймазы
- •1 100 200 300 400 500 582
- •1 2 3 4 5 6
- •2.4. Днк-лигазы
- •2.5. Днк-топоизомеразы
- •Литература
- •Глава 3. Инициация репликации хромосомной днк
- •3.1. Инициация репликации хромосомы e. Coli
- •3.1.1. Белок-инициатор DnaA
- •1 56 129 350 429
- •Ihf r5(m)
- •3.1.3. Этапы инициации репликации на онр oriC
- •3.1.4. Регуляция инициации репликации хромосомы e. Coli
- •Секвестрирование oriC
- •3.2. Инициация репликации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
- •3.2.1. Области начала репликации (онр) ars и комплекс узнавания онр (orc)
- •Gaaaagcaagcataaaagatctaaacataaaa tctgtaaaataaca
- •Изогнутыми стрелками отмечены сайты инициации двунаправленной репликации хромосомной днк. Приведена последовательность комплементарной нити сайта acs
- •3.2.2. Этапы пути инициации репликации на онр у дрожжей
- •3.3. Инициация репликации у высших эукариотов
- •3.3.1. Белковые компоненты и путь инициации репликации
- •3.3.2. Проблема существования областей начала репликации у высших эукариотов
- •90 40 60 165 330 65 190 (П.Н.)
- •17 5 23 (Т.П.Н.)
- •55 Т.П.Н.
- •Caaaagcaagacaaa gacaagc tccaaataagattca Ori хомячка (cho)
- •3.4. Регуляция инициации репликации в эукариотических клетках
- •Литература
3.2. Инициация репликации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
3.2.1. Области начала репликации (онр) ars и комплекс узнавания онр (orc)
У S. cerevisiae были идентифицированы специфические элементы хромосомной ДНК, названные автономно реплицирующимися последовательностями ARS (autonomously replicating sequences). Встраивание этих элементов в кольцевые плазмидные ДНК обеспечивает автономную репликацию плазмид в клетках дрожжей. С использованием метода двумерного гель-электрофореза, позволяющего обнаружить репликативные пузырьки ДНК, было показано, что элементы ARS совпадают с сайтами начала двунаправленной репликации ДНК как в содержащих ARS плазмидах, так и в самих дрожжевых хромосомах. Таким образом, последовательности ARS являются функциональными ОНР хромосомной ДНК S. cerevisiae. Эти свойства дрожжевых ОНР значительно облегчили их изучение.
В 16 хромосомах S. cerevisiae содержатся от 250 до 400 ОНР. Все изученные элементы ARS у дрожжей, имеющие модульную структуру, состоят из доменов А и В и имеют длину 100-150 п.н. (рис. 3.5). Домен А содержит консенсусную последовательность, названную ACS (ARS consensus sequence). Элемент ACS длиной 11 п.н. имеет первичную последовательность (A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T), являющуюся существенной для инициации репликации. Даже одиночные замены нуклеотидов в ACS могут устранить активность ARS. Тем не менее, некоторые известные ARS, содержащие одну и даже две измененные пары нуклеотидов по сравнению с ACS, являются эффективными ОНР. С другой стороны, не каждая последовательность ACS в геноме проявляет активность ОНР в отсутствие других доменов ARS.
Домен В в ARS состоит из 3 элементов. Ближайший к ACS элемент В1 образует вместе с ACS сайт связывания белкового комплекса узнавания ОНР. Богатый остатками А и Т элемент В2 выполняет функцию элемента расплетания ДНК DUE. Репликация ДНК в прототипной хромосомной ОНР ARS1 инициируется примерно посередине между сегментами В1 и В2. Элемент В3 в некоторых ARS связывает фактор транскрипции Abf1 и играет роль вспомогательного элемента AUX, обеспечивающего оптимальную эффективность инициации репликации. Элементы доменов В в различных элементах ARS у дрожжей гораздо менеее консервативны, чем домен А. Наиболее консервативным из них является элемент В1.
В прототипный элемент ARS1 иногда включают и третий домен С, расположенный по другую сторону от ACS и упакованный в уникально позиционированную нуклеосому. Эта нуклеосома, вероятно, понижает вероятность упаковки смежного сайта ACS в другую нуклеосому, которая могла бы подавить активность ARS1.
C последовательностью ACS и смежным сегментом В1 в дрожжевых ARS на протяжении почти всего клеточного цикла связан белковый комплекс узнавания ori (ORC – origin recognition complex). Общее количество комплексов ORC в одной клетке примерно соответствует числу ARS. Этот комплекс состоит из 6 белков, кодируемых существенными генами ORC1-ORC6. Аналогичные комплексы ORC имеются у всех эукариотов (табл. 4.1). Три субъединицы комплекса (Orc1, Orc4 и Orc5) содержат сайты связывания нуклеотидов, как у ДНК-зависимых АТФаз, и относятся к семейству АТФаз ААА+. Самая большая субъединица Orc1 может гидролизовать АТФ in vitro, но в присутствии ДНК ARS гидролиз АТФ предотвращается. По-видимому, как и в случае белка DnaA, связанный АТФ играет в ORC роль аллостерического эффектора, требующегося для специфической ассоциации с последовательностями ДНК ARS, а гидролиз АТФ идет на более поздних стадиях инициации репликации.
AAATTTCGAAAAATGCT AAGAAATAGGTTAGTACTGAGTAGT
B3
ATTTATTTAAGTATT GTTTGTGCACTTGCCTG CAAGGGCCTTTT
B2