1 56 129 350 429

NI II III IV C

1 6

2 2 5

Рис. 3.1. Структура белка DnaA E. coli.

I-IV - области гомологии бактериальных белков DnaA; 1 – домен олигомеризации, 2 – области связывания с геликазой DnaВ, 3 – сайт связывания нуклеотидов, 4 – домен АТФазной активности, 5 – участок взаимодействия с мембранными фосфолипидами, 6 – домен связывания с ДНК.

3.1.2. Минимальная область начала репликации oriC y E.coli

Область начала репликации (ОНР) oriC является уникальным местом инициации нормальной двунаправленной репликации хромосомы E. coli и расположена на 84-ой мин генетической карты. Минимальная ОНР oriC имеет длину 245 п.н. (рис. 3.2). Секвенирование показало, что ОНР кольцевых хромосом других бактерий являются “множественно мутированными” вариантами oriC E. coli. Минимальные ОНР состоят из нескольких консервативных участков и из участков с одинаковой длиной, но разными последовательностями, которые, подобно участкам между блоками –10 и –35 бактериальных промоторов, играют в ОНР роль неконсервативных спейсеров.

Бактериальные ОРС содержат сайты GATC, остатки А в которых специфически метилируются ДНК-метилазой Dam. Число таких сайтов у разных бактерий составляет от 9 до 14. У E. coli в минимальной ОНР oriC содержатся 11 таких сайтов. Эти сайты, играющие важную роль в регуляции инициации репликации, довольно равномерно распределены по oriC и имеют одинаковую ориентацию.

Минимальная ОНР oriC состоит из 2 модулей. Правые 2/3 занимает модуль взаимодействия с белком DnaA. В этой области содержатся 5 потенциальных сайтов связывания DnaA (сайты R1-R5). Два из этих сайтов (R1 и R4) имеют последовательность ТТАССАСА, совпадающую с консенсусным блоком DnaA, и обладают наибольшим сродством к белку-инициатору. Два других сайта (R2 и R3) отличаются от консенсуса всего в одном положении из 9, но являются более слабыми сайтами связывания DnaA. В центре расположен сайт R5(M), который отличается от консенсусной последовательности в 3 положениях. Пары сайтов R1-R2 и R3-R4 организованы в виде инвертированных повторов. Правая область содержит также потенциальные сайты связывания двух архитектурных гистоноподобных белков E. coli: хозяйского фактора интеграции IHF и фактора стимуляции инверсии Fis.

Левая треть ОНР oriC занята АТ-богатыми последовательностями, в которых происходит плавление днДНК во время инициации. Она состоит из 3 прямых повторов длиной 13 п.н. (“13-меров” L, M и R), каждый из которых начинается сайтом GATC и содержит 9-11 пар А:Т. Кроме того, с 5’-стороны от блока 13-меров расположен участок длиной 12 п.н., из которых 11 являются парами А:Т. Для инициации репликации необходимо специфическое взаимодействие белка DnaA с 13-мерами R и М, в которых допустимы очень немногие замены оснований. Левый 13-мер L можно сильно изменить без утраты oriC способности к инициации, лишь бы этот участок остался АТ-богатым. 5’-фланговая АТ-богатая область также участвует в раскрывании двойной спирали ОНР.