2.Суперовуляційна обробка тварин.

Суперовуляція – штучне збільшення кількості яйцеклітин, що овулюють в яєчнику при введенні гормональних препаратів. Загальна кількість яйцеклітин, які овулюють протягом усього життя статево зрілої самки в багато сотень разів менша, ніж кількість потенціальних яйцеклітин (первинних), що є в яєчнику. Так, в яєчнику корови міститься кілька сот тисяч незрілих яйцеклітин (ооцитів), що перебувають у стадії незавершеного мейозу. Протягом життя, з 9 міс. віку, коли яєчник повинен функціонувати, корова витрачає 60-70 яйцеклітин і залишає після себе лише 10-12 (найчастіше 5-6) потомків. Отже, кількість сот тисяч ооцитів, які після стимуляції можуть нормально розвиватися, є важливим резервом тваринництва майбутнього, і однією з технологій, яка використовує ці потенціальні можливості тварин, є біотехнологія трансплантації.

Тепер у практиці тваринництва, щоб зумовити множинну овуляцію, широко застосовується гормональний метод. Теоретичні основи його розроблено в 30-і роки радянськими вченими під керівництвом академіка М. М. Завадовського. Стимулюючи множинну овуляцію (суперовуляцію) штучним підвищенням концентрації гонадотричних гормонів у крові, вдається в 10-20 разів збільшити кількість утворюваних у кожному циклі яйцеклітин (до 25 у корів та овець і до 90 в поліовулюючих тварин). Проте добиваються тільки подвоєння плодючості, оскільки кількість виношуваних ембріонів детермінована анатомією і фізіологією репродуктивних органів. Практичне значення метод має лише для стимуляції багатоплідності в овець (народження двійнят). Для збільшення кількості народжених телят та одержання двійнят і трійнят метод суперовуляції перспективний лише в індивідуальних випадках, тому що у корів факторами, які лімітують багатоплідність, є величина плодів і суміщення стільності з лактацією, використання великої кількості об’ємних кормів.

Щоб досягти суперовуляції, у світовій практиці найчастіше застосовують фолікулостимулюючий гормон (ФСГ), або гонадотропін сироватки жеребних кобил (ГСЖК) у поєднанні з простагландинами. Обробку починають у середині статевого циклу з 9-го по 4-ий день (тічки вважається “0” днем). Через 2-3 дні після початку обробки тваринам вводять простагландин F2L (ПГF2L) або його аналоги, щоб спричинити регресїю жовтого тіла.

Дослідженнями вітчизняних та зарубіжних вчених щодо випробування різних гонадотропинів доведено, що стандартні препарати СЖК за ефективністю зумовлення суперовуляції є гіршими, ніж гіпофізарний фолікулостимулюючий гормон (ФСГ), хоча використання його пов’язане з великою трудомісткістю.

Препарат СЖК вводять у дозі 2000-3000 МО одноразово, оскільки період напіврозпаду в організмі становить 2-5 діб. Слід зазначити, що тривала дія препарату на функцію яєчників у період, який передує статевій охоті, і після неї порушує нормальний рівень статевих гормонів у організмі самки знижуючи вихід повноцінних яйцеклітин і ембріонів.

ФСГ з періодом напіввиведення 6 год ін’єктується 8-10 разів протягом 4-5 днів з інтервалом 12 год у сумарній дозі 30-40-50 мг. Дослідженнями не встановлено відмінності в реакції між 4 і 5 днями, тому найбільш практичним вважають чотириденний режим з ін’єктуванням через 12 год.

Слід зазначити, що овуляторна реакція тварин на гонадотропін дуже непостійна, навіть при використанні тієї самої дози того самого гонадотропіну. Ефективність гормональної обробки великою мірою залежить від фізіологічного стану яєчників, типу і дози гормональних препаратів, індивідальної чутливості до гонадотропіну, умов годівлі та утримання. Тому ця ланка є, мабуть, найскладнішою з технології трансплантації ембріонів.

Після гормональної обробки фолікули у донорів овулюють не пізніше як через 6 год. після перших ознак охоти, а овуляція триває 60 год після її початку. Осіменяти донорів необхідно через 12-24, а іноді і через 36 год після встановлення перших ознак охоти з подвійною дозою сперми високої якості. Підвищення числа доз сперми, для того щоб компенсувати її низьку якість, не дає ефекту, а велика кількість мертвих сперматозоїдів знижує життєздатність зародка.

Добування зародків.

Спосіб добування ембріонів обумовлений строками їх пересування по статевому тракту. Існує два методи добування і пересаджування ембріонів: хірургічний і не хірургічний. Хірургічний метод потребує більших витрат і затрат праці. Для нього характерною є обмежена можливість багаторазового використання корів-донорів. При хірургічній трансплантації доступ до статевих органів забезпечується хірургічними методами під місцевим наркозом у стоячому положенні тварини. Ембріони за цим методом вимивають на 4-й день після тічки. Між 4-м і 5-м днями ембріони переходять з яйцепроводу в матку і з цього моменту можливе не хірургічне добування їх.

Останнім часом у більшості країн світу набув поширення не хірургічний метод добування і пересаджування зародків через шийку матки за допомогою спеціальних катетерів. Оптимальними строками для добування вважають 6-8-му добу. Рідину для промивання (200-300 мл) декілька разів (5-8) пропускають через ріг матки, де на 7-му добу естрального циклу міститься більшість зародків. Більшість ембріонів (біля 70%) вимивається легко, однак деякі ембріони добувають після декількох промивань, тому промивання повторюють 5-6 разів.

В якості промивної рідини використовують фосфатний буфер Дюльбеко, який збагачений глюкозою і бичачим сироватчастим альбуміном, або 1 %- ною ембріональною сивороткою крові. Таку процедуру повторюютть і з другим рогом матки. Рідину вводять переривчатою або не переривчатою протоковою системою (самопливом), або шприцевим методом. Цю маніпуляцію звичайно проводять без наркозу, фіксуючи корову в стоячому положенні (бажано, щоб задні кінцівки були трохи вищі за передні).

Промивну рідину збирають у великі градуйовані циліндри або у флакони. Через 30 хв. рідину розглядають під мікроскопом для виявлення ембріонів. Ембріони до пересадки зберігають в чашках Петрі в культуральному середовищі. Для добування ембріонів та подальших маніпуляцій з ними використовують різні середовища. РН в середовищах повинен підтирмуватись на рівні 7,2-7,6. Традиційно (за кордоном) ембріони збирають в культуральне середовище.

Розвиток зародка в зародковий період.

Зародок – організм на ранніх стадіях розвитку, тобто в початковий період ембріонального розвитку, коли проходять основні зміни будови - морфогенез. У ссавців запліднення проходить в маточних каналах і запліднені яйцеклітини не поступають в матку на протязі 3-4 та більше днів. Так, зародки корови та овець поступають в матку через 66-72 г після овуляції на стадії розвитку від 8 до 16 клітин, тоді як у свиней - через 46-48 год після овуляції на стадії 4 клітин. Швидкість пересування зародків по маточним каналам находяться під контролем стероїдних гормонів яєчників, а час надходження їх в матку є вирішальним фактором для подальшого ембріонального розвитку та успішній стільності.

В той час, коли ембріони находяться в фалопієвих трубах (маткові труби), у матці проходять підготовчі процеси до прийняття плоду. Так, за допомогою фагоцитозу видаляються продукти, які залишилися після статевого акту. Збільшується вироблення прогестерону жовтим тілом, що призводить до підвищення активності та секреції рідини в просвіт матки. Маточна рідина, змішуючись з деякими компонентами клітин, утворює гістотроф - маточне молоко.

На перших стадіях поділу, заплідненна яйцеклітина дробиться на бластомери (клітини), які відрізняються округлою формою, і на початку ділення вони круглі. З кожним новим поділом бластомери стають менші, так як збільшення росту, при поділі не проходить. У бластомерів порушується ядерно-цитоплазматичне відношення: ядра завдяки мітозу зберігають свій об’єм, а цитоплазма з кожним новим діленням зменшується вдвоє. На стадії 8 бластомерів з’являються відмінності в їх розмірах: великі темні – зародкові і малі світлі – внезародкові. На 4-5-у добу після запліднення бластомери які діляться, утворюють щільну групу, наприклад з 16-32 клітин - ранню морулу, а на 5-7-у добу - зародок представляє собою клітинній комплекс з 32-90 бластомерів - пізню морулу. Коли клітини морули починають виробляти рідину і перегруповуватися навколо центральної, наповненої рідиною порожнини, проходить утворення бластоцисти (7-8-ма доба).

В бластоцисті проходить швидка диференціація клітин: темні (базофільні) клітини формують масу внутрішніх клітин, тобто власне зародок. А з іншої групи клітин (світлих) розвиваються позазародкові оболонки – трофобласт. Тому, плодові оболонки є тканинами, які спеціалізуються на взаємодії з маткою (без відторгнення при імплантації, незважаючи на наявність батьківських антигенів).

Шар ендодерми, який утворюється з маси внутрішнього шару клітин, дає початок двохшаровій бластоцисті з слідуючи утворенням мезодерми. Під час початкової стадії формування бластоцисти зародок ще находиться під захистом прозорої оболонки, яка скидається по мірі подальшої диференціації клітин (у В. Р. Х. – на 10-й день).

Ріст і розширення бластоцисти визиває розтягування та утончення оболонки і тим самим сприяє її розриву.

В передімплантаційну фазу після виходу зародка з прозорої оболонки проходить дальший ріст бластоцисти. Він супроводжується переходом зародка від округлої до більш витягнутої форми, яка нагадує червоподібну втулку (на 12-у добу). До 13-ї доби величина бластоцисти досягає приблизно 5 мм в діаметрі, а до 16-о дня бластоциста може займати 2/3 довжини рога матки.

Ще до імплантації після скидання прозорої оболонки потреба зародка плоду в поживних речовинах задовольняється в основному за рахунок складових частин рідини матки завдяки трофобласту. На цій стадії ріст ембріону значно обумовлений білковими компонентами. Тому незадовго до імплантації наступає критичний період життєдіяльності ембріона, який залежить від стану матері.

Оцінка якості ембріонів. При морфологічній оцінці якості ембріонів враховується розмір самих зародків, кількість та розмір бластомерів, цілісність клітинних оболонок, форми, колір та кількість відокремлених клітин із загальної клітинної маси. По якості ембріони бувають відмінні, добрі, посередні, дегенерованi і мертві. Відмінні або дуже добрі - структура ембріону без видимих змін; добрі – мають невеликі морфологічні відхилення, тобто один або два вільних бластомери зі слабким загином клітинної структури; погані – розрив прозорої оболонки або повне руйнування бластомерів.

Найбільш оптимальною стадією розвитку ембріонів для трансплантації, заморожування і маніпулювання є стадія пізньої морули і ранньої бластоцисти. В основному у В. Р. Х. ця стадія наступає на 7-8-й день після першого осіменіння.

Після ідентифікації ембріони промивають в стерильному середовищі і вони можуть зберігатися як короткочасно (до 24 год.) так і довго. При короткочасному зберіганні (до пересадки) ембріони розміщують в спеціальні середовища і зберігають в термостаті при t 37⁰С або при кімнатній t=20-25⁰С без суттєвої зміни їх життєздатності. Найбільш перспективним методом тривалого зберігання ембріонів поза організмом є метод кріоконсервації з використанням рідкого азоту.

Глибоке заморожування ембріонів. Глибоке заморожування є оптимальним методом для транспортування біологічних об’єктів на далекі віддалі або при міжнародному обміні.

Технологія глибокого заморожування сперми добре відпрацьована. Із застосуванням заморожування ембріонів з’явилася можливість тривалого їх зберігання і відпала необхідність утримання великої кількості реципієнтів з метою підбору самок на синхронній з донором стадії статевого циклу, поліпшенню умов їх утримання. Крім того, можна контролювати сезон розтелення, хоча збір ембріонів і їх заморожування можна проводити цілий рік.

В результаті багаторічних робіт визначилися два основних напрямки в кріоконсервації ембріонів: одноетапний і двоетапний.

При одно етапному методі ембріони повільно охолоджуються до -70-80⁰С, при цьому проходить дегідратація клітин з послідуючим переходом в твердий стан і повільне відтаювання ембріонів, при якому регідратація клітин протікає повільно, не руйнуючи структури клітин. Однак при дуже повільному охолодженні внеклітинні розчини отримують багато солі, що спонукає руйнуванню клітинних мембран.

Заморожування ембріонів проводиться при цьому методі в слідуючому режимі: охолодження - від +20⁰С до -7⁰С зі швидкістю 1⁰С/хв; кристалізація - при -7⁰С; охолодження - від -7⁰С до -36⁰С зі швидкістю 0,3⁰С/хв, від -36⁰С до -60⁰С зі швидкістю 0,1⁰С/хв і швидке занурення в рідкий азот. Кристалізацію внеклітинного середовища проводять, доторкуючись зовнішньої стінки соломки або сосуда холодним пінцетом, попередньо охолодженого в рідкому азоті. Проби витримують при t⁰ висівання на протязі 5-10 хв, щоб дати можливість середовищу кристалізуватися для переходу в рівновагу. Повільне відтаювання ембріонів проводять спочатку в спиртовій бані від -50⁰С до -10⁰С зі швидкістю 4⁰С/хв, а потім у бані при +25⁰С.

Двоетапний метод – це повільне охолодження до -38⁰С (-40⁰С), потім швидке заморожування та швидке відтаювання. При такій технології кріоконсервації ембріонів повної дегідратації клітин не проходить, тому їх відтаюють з підвищеною швидкістю. Ембріони заморожують в слідуючому режимі: від +20⁰С до -7⁰С зі швидкістю 1⁰С/хв; від -7⁰С до -35⁰С по 0,3⁰С/хв; від -35⁰С до -38⁰С (-40⁰С) по 0,1⁰С/хв. Потім занурюють в рідкий азот для зберігання. Відтаювання проводять у водяній бані при t +37⁰С на протязі 30 сек.

Для заморожування використовують свіжі ембріони відмінної якості у віці (днів): для в. р. х. - 7-8, овець і кіз - 5-6, свиней - 4-5, тобто ембріони в стадії морули і бластоцисти. В якості кріопротектору використовують гліцерін. На основі фосфатно - сольового буферу або середовища Дюльбеко готовлять 4-5 концентрацій гліцерина; 0,25; 0,75; 0,5 і 1,5 м. Перед заморожуванням відмінні ембріони витримують по 5 хв. в прогресивно збільшуючій концентрації кріопротектора при кімнатній t⁰. Після розморожування ембріонів для ліквідації кріопротектора їх проводять через знижаючі концентрації гліцерина з градієнтом, рівним 0,25 М, тобто починаючи з 1,5 або1 М розчину і закінчуючи 0,25 М. витримують ембріони в кожному розчині 10 хв. з цією метою використовується концентрація сахарози 0,5 і 0,25 М.

Дослідами встановлено, що метод кріоконсервації дозволяє заморожувати ембріони на тривалий строк і 70% з них відновлюються після відтаювання.

Розробки методів кріоконсервації ембріонів допоможе значно підвищити рентабельність трансплантації. Це пов’язано з тим, що при трансплантації ембріонів великі витрати йдуть на синхронізацію донорів та реципієнтів, так як на протязі короткого часу неможливо трансплантувати всі ембріони, які отримали.