3. Метод Кьельдаля (в настоящее время не является фармакопейным для аминокислот за исключением пирацетама – видоизмененный метод Кьельдаля).

3.1. Классический метод Кьельдаля. Определение проводят титриметрическим методом после минерализации ЛС концентрированной серной кислотой при нагревании, в присутствии катализаторов (калия сульфата и меди сульфата пентагидрата в соотношении 10:1 или других катализаторов, указанных в частной статье) и разложения образующегося аммония сульфата раствором натрия гидроксида. Аммиак улавливается раствором борной кислоты. Различают следующие методы определения азота в классическом методе Кьельдаля: А. метод Кьельдаля, Б – микрометод Кьельдаля, В – метод обратного титрования.

А. Метод Кьельдаля.

_>t^o

ЛС + конц. H₂SO₄ + катализаторы → (NH₄)₂SO₄ + CO₂ + H₂O

(NH₄)₂SO₄ + 2NaOH → NH₃ + Na₂SO₄ + 2H₂O

NH₃ + H₃BO₃ → NH₃ ^. H₃BO₃

Отгон титруют раствором хлороводородной или серной кислоты (индикатор смешанный: метиловый красный и метиленовый синий).

NH₃ ^. H₃BO₃ + HCl → NH₄Cl + H₃BO₃ , или

2NH₃ ^. H₃BO₃ + H₂SO₄ → (NH₄)₂ SO₄ + 2H₃BO₃

Параллельно проводят контрольный опыт.

Б. Микрометод Кьельдаля.

Все операции проводят аналогично классическому методу Кьельдаля, но используют аппарат для автоматического определения азота. В качестве катализаторов добавляют смесь, указанную в методе А или другой вариант: смесь калия сульфата, меди сульфата пентагидрата и натрия селената десятиводного в соотношении 20:5:8.

В. Метод обратного титрования (полумикрометод Кьельдаля).

Операции проводят как в методе А, выделившийся аммиак улавливают избытком титрованного раствора хлороводородной кислоты, остаток кислоты титруют раствором натрия гидроксида в присутствии смешанного индикатора. Параллельно проводят контрольный опыт.

NH₃ + HCl → NH₄Cl

Избыток HCl + NaOH → NaCl + H₂O

3.2. Видоизмененный метод Кьельдаля. Применяется для количественного определения пирацетама (субстанция, таблетки, раствор для инъекций) (ФС). Основан на свойстве пирацетама гидролизоваться в щелочной среде с образованием эквивалентного количества аммиака (см. реакцию подлинности). Аммиак отгоняют в установке Кьельдаля и количественно улавливают раствором борной кислоты. Отгон титруют раствором хлороводородной кислоты по смешанному индикатору (метиловый красный и метиленовый синий).

NH₃ + H₃BO₃ → NH₃ ^. H₃BO₃

NH₃ ^. H₃BO₃ + HCl → NH₄Cl + H₃BO₃

4. Инструментальные методы. Спектрофотометрия.

Применяют для определения ЛС в лекарственных препаратах промышленного производства (таблетки, гранулы, растворы для инъекций).

4.1. УФ-спектрофотометрия.

Используется для количественного определения соединений с SH-группой, поглощающих свет в УФ области спектра: (цистеин, ацетилцистеин, пеницилламин).

4.2. Спектрофотометрия в видимой области спектра. Используется для количественного определения ЛС, не поглощающих свет в УФ области, т.е. остальных ЛС этой группы.

ЛС не окрашены, поэтому необходимо получить окрашенные продукты. С этой целью применяют реакции:

Реакция с аллоксаном (аналогом нингидрина):

• ФС: ЛП «Гранулы кислоты глутаминовой для детей».

Реакцию проводят в среде ДМФА. Образуется мурексид (аммониевая соль пурпурной кислоты). У продукта реакции, окрашенного в красный цвет, определяют оптическую плотность. Расчет содержания ЛС в препарате проводят с использованием оптической плотности стандартного раствора.

Количество кислоты глутаминовой в граммах в одном пакете гранул (Х) рассчитывают по формуле:

_Х= Аx * Ccт.(%) * Vразв. x * P (г)

Аст. * a_x (г) * 100

Реакция с нингидрином.

Предложены методики количественного определения многих алифатических аминокислот в лекарственных препаратах.

У продукта реакции цвета измеряют оптическую плотность (max сине-фиолетового поглощения при λ 568 нм).

Расчет содержания ЛС в препарате проводят с использованием оптической плотности стандартного раствора.

Определение пирацетама (не является аминокислотой).

Используют реакцию образования индофенола.

Проводят реакцию щелочного гидролиза пирацетама. Выделяется аммиак. Он реагирует с гипохлоритом натрия (окислитель) и фенолом.

NaOH

Пирацетам → NH₃ ↑

Фенол + NH₃ + NaOCl → Индофенол

(окислитель)

Индофенол окрашен в синий цвет (max поглощения при λ 630 нм).