2006_-Byelorussian_Pharmacopoeia_Volume_1

перемешивают круговыми движениями. Во избежание чрезмерных потерь серной кислоты горло колбы неплотно закрывают пробкой (например, подходящей грушевидной пробкой с коротким отростком). Колбу нагревают, постепенно доводя

до кипения с конденсацией серной кислоты в горле колбы; при этом необходимо следить за тем, чтобы верхняя часть колбы не перегревалась. Нагревание

продолжают в течение 30 мин, если нет других указаний в частной статье. Охлаждают, растворяют твердый остаток, осторожно прибавляя к смеси 25 мл воды Р, опять охлаждают и подсоединяют к прибору для перегонки с водяным паром.

Прибавляют 30 мл раствора натрия гидроксида концентрированного Р и

немедленно перегоняют, пропуская пар через смесь. Собирают около 40 мл отгона в

приемник, содержащий 20,0 мл 0,01 М раствора кислоты хлористоводородной и

достаточное количества воды Р для того, чтобы конец холодильника был погружен в жидкость. В конце перегонки приемник опускают таким образом, чтобы конец

холодильника находился над поверхностью жидкости. Необходимо исключить

попадание жидкости на внешнюю поверхность холодильника из содержимого

приемника.

# По окончании отгонки конец холодильника промывают снаружи небольшим количеством воды Р, собирая промывную воду в тот же приемник.

Отгон титруют 0,01 М раствором натрия гидроксида, используя в качестве

индикатора смешанный раствор метилового красного Р до перехода окраски из красно-фиолетовой в зеленую (V1 мл 0,01 М раствора натрия гидроксида).

Испытания повторяют, используя вместо испытуемого вещества около 50 мг

глюкозы Р.

Содержание азота = 0,01401× (V2 -V1 ) % , m

где:

m – масса испытуемого вещества, г;

V1 – объем 0,01 М раствора натрия гидроксида, пошедшего на титрование раствора, полученного после сжигания испытуемого вещества, мл;

V2 – объем 0,01 М раствора натрия гидроксида, пошедшего на титрование раствора, полученного после сжигания глюкозы, мл.

Рис. 2.5.9.-1. Прибор для определения азота

2.5.10.МЕТОД СЖИГАНИЯ В КОЛБЕ С КИСЛОРОДОМ

#Сущность метода сжигания органических веществ в колбе с кислородом состоит в разрушении органических веществ сожжением в атмосфере кислорода,

дальнейшем растворении образовавшихся продуктов горения в поглощающей жидкости и последующем определении элементов, которые находятся в растворе в

виде ионов. Метод обычно используют для определения галогенов (хлора, брома, йода, фтора), серы и фосфора.

#Если не указано иное, колба для сжигания это коническая колба

вместимостью от 750 мл до 1000 мл из термостойкого стекла со шлифом. В пробку колбы впаяна платиновая проволока диаметром около 0,75 мм с корзиночкой или

спиралью на конце (держатель образца) (Рис. 2.5.10.-1), который находится на расстоянии около 2 см от дна колбы. Колба для сжигания должна быть тщательно вымыта и свободна от следов органических веществ и растворителей.

Указанное в частной статье количество мелкоизмельченного вещества помещают в центр фильтровальной бумаги размером от 30 мм до 40 мм с

небольшой полосой шириной 10 мм и длиной 30 мм.

# Фильтровальную бумагу (Рис. 2.5.10.-2) заворачивают в виде пакетика, оставляя узкую полоску. В случае испытания жидкостей, их помещают в капилляр,

запаянный парафином, или в капсулу из полиэтилена, нитропленки или метилцеллюлозы. Для трудно летучих жидкостей возможно применение двойного бумажного пакетика. При испытании мазеподобных веществ применяют капсулу из

нитропленки или пакет из вощёной бумаги. Капсулы и капилляры заворачивают в

пакетик из фильтровальной бумаги, оставляя узкую полоску. При анализе твердых и мазеобразных соединений, сгорающих со вспышкой, к навеске прибавляют 3-5 мг парафина. Приготовленную пробу помещают в держатель.

Если в частной статье указана бумага, пропитанная лития карбонатом, перед

использованием центр бумаги увлажняют насыщенным раствором лития

карбоната Р и сушат в сушильном шкафу. Испытуемое вещество заворачивают в бумагу и помещают в держатель образца. Помещают в колбу воду Р или указанный

раствор, предназначенный для поглощения продуктов горения. С помощью трубки,

конец которой находится выше уровня жидкости, вытесняют воздух из колбы, пропуская поток кислорода. Смачивают горловину колбы водой Р, поджигают узкий

конец фильтровальной бумаги с соблюдением мер предосторожности и закрывают колбу пробкой.

# Для соблюдения мер предосторожности необходимо: надеть защитные очки, колбу поместить в предохранительный чехол, установить защитный экран.

Во время сжигания необходимо придерживать пробку колбы рукой. После

сжигания колбу энергично встряхивают до полного растворения продуктов горения. Колбу охлаждают в течение 5 мин, если нет других указаний, и осторожно

открывают. Обмывают дно, стенки колбы и держатель образца водой Р. Объединяют продукты горения и жидкость после промывки. Определение проводят методом,

указанным в частной статье.

Рис. 2.5.10.-1. Прибор для сжигания в

кислороде

Рис. 2.5.10.-2. Фильтровальная бумага

для приготовления пакетика

2.5.11.КОМПЛЕКСОМЕТРИЧЕСКОЕ ТИТРОВАНИЕ

#Комлексометрическое титрование – это группа методов титрования,

основанных на реакциях образования растворимых в воде комплексных соединений.

#Комплексонометрическое титрование как частный случай

комплексометрического титрования основано на реакции комплексообразования

катионов металлов с комплексонами – аминополикарбоновыми кислотами и их

солями. Образующиеся комплексные соединения называют комплексонатами.

#Для комплексонометрического титрования в качестве титранта обычно применяют динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, известную под названиями: натрия эдетат, трилон Б, комплексон III, хелатон III и др.

#Натрия эдетат образует с катионами многовалентных металлов устойчивые

и хорошо растворимые в воде комплексонаты в стехиометрическом отношении 1:1 и

используется для количественного определения алюминия, висмута, кальция,

свинца, магния и цинка в лекарственных средствах.

#Индикаторы, применяемые для визуального обнаружения конечной точки титрования, называются металлоиндикаторами. Большинство из них (металло хромные индикаторы) являются органическими красителями и обладают свойством изменять окраску при образовании комплексных соединений с катионами металлов. Металлоиндикаторы для комплексонометрии подбирают таким образом, чтобы их

взаимодействие с катионами определяемых металлов было обратимым и устойчивость их комплексов была значительно меньше устойчивости

комплексонатов, образующихся в процессе титрования.

#Прямое титрование растворами натрия эдетата проводят следующим образом: к анализируемому раствору, если необходимо, нейтрализованному, прибавляют буферный раствор для создания требуемого значения рН, затем прибавляют металлоиндикатор. В процессе титрования раствором натрия эдетата в

конечной точке титрования окраска раствора изменяется от окраски комплекса

металлоиндикатора с титруемым катионом металла до окраски свободного металлоиндикатора.

#При обратном титровании к испытуемому раствору прибавляют натрия

эдетат и его избыток оттитровывают при определенном значении рН в присутствии соответствующего металлоиндикатора растворами солей цинка, магния, свинца и

др.

#Допускается использование в качестве титранта 0,05 М раствор натрия эдетата, что должно быть указано в частной статье.

АЛЮМИНИЙ

20,0 мл раствора, указанного в частной статье, помещают в коническую колбу

вместимостью 500 мл, прибавляют 25,0 мл 0,1 М раствора натрия эдетата и 10 мл смеси равных объемов раствора 155 г/л аммония ацетата Р и кислоты уксусной разведенной Р, кипятят в течение 2 мин и затем охлаждают. Прибавляют

50 мл этанола Р и 3 мл свежеприготовленного 0,25 г/л раствора дитизона Р в этаноле Р. Титруют избыток натрия эдетата 0,1 М раствором цинка сульфата до

перехода зеленовато-синей окраски раствора в красно-фиолетовую.

1 мл 0,1 М раствора натрия эдетата соответствует 2,698 мг AI.

# Допускается проводить определение алюминия по следующей методике:

Точную навеску испытуемого вещества, эквивалентную 0,02–0,03 г алюминия,

растворяют в 2 мл 1 М раствора кислоты хлористоводородной и 50 мл воды Р.

Прибавляют 50 мл 0,05 М раствора натрия эдетата и нейтрализуют 1 М

раствором натрия гидроксида, используя в качестве индикатора метиловый

красный Р. Раствор нагревают до кипения и выдерживают на кипящей водяной бане в течение 10 мин, охлаждают, прибавляют 50 мг индикаторной смеси ксиленолового оранжевого Р, 5 г гексаметилентетрамина Р и титруют избыток натрия эдетата 0,05 М раствором свинца нитрата до розовато-фиолетового

окрашивания.

1 мл 0,05 М раствора натрия эдетата соответствует 1,349 мг AI.

ВИСМУТ

Раствор, указанный в частной статье, помещают в коническую колбу

вместимостью 500 мл. Доводят объем водой Р до 250 мл и затем, если нет других

указаний в частной статье, прибавляют по каплям, при перемешивании, раствор аммиака концентрированный Р до помутнения смеси. Затем прибавляют 0,5 мл

кислоты азотной Р, нагревают при температуре около 70°C до полного исчезновения помутнения. Прибавляют около 50 мг индикаторной смеси ксиленолового оранжевого Р и титруют 0,1 М раствором натрия эдетата до перехода розовато-фиолетовой окраски раствора в желтую.

1 мл 0,1 М раствора натрия эдетата соответствует 20,90 мг Bi.

КАЛЬЦИЙ

Раствор, указанный в частной статье, помещают в коническую колбу

вместимостью 500 мл и доводят объем водой Р до 300 мл. Прибавляют 6,0 мл

раствора натрия гидроксида концентрированного Р и около 15 мг индикаторной смеси кальконкарбоновой кислоты Р. Титруют 0,1 М раствором натрия эдетата

до перехода фиолетовой окраски раствора в синюю.

1 мл 0,1 М раствора натрия эдетата соответствует 4,008 мг Ca.

# Допускается проводить определение кальция по следующей методике:

Точную навеску препарата, эквивалентную 0,04-0,05 г кальция, растворяют,

как указано в частной статье, в воде Р или кислоте хлористоводородной разбавленной Р. Доводят объем раствора водой Р до 50 мл, прибавляют 10 мл

буферного раствора с рН 9,5-10,0; 0,1 г индикаторной смеси хромового темно-синего (0,25 г хромового темно-синего и 25 г натрия хлорида растирают в ступке и перемешивают) или 7 капель раствора хромового темно-синего (0,5 г хромового

темно-синего растворяют в 10 мл аммиачного буферного раствора (рН от 9,5 до 10,0) и доводят объем раствора 95 % спиртом до 100 мл, срок годности раствора 1

мес) и титруют 0,05 М раствором натрия эдетата до сине-фиолетового окрашивания.

1 мл 0,05 М раствора натрия эдетата соответствует 2,004 мг Ca.

МАГНИЙ

Раствор, указанный в частной статье, помещают в коническую колбу

вместимостью 500 мл и доводят объем раствора до 300 мл водой Р. Прибавляют 10

мл аммиачного буферного раствора рН 10,0 Р и около 50 мг индикаторной смеси

протравного черного 11 Р (эриохром черный Т). Раствор нагревают до температуры около 40°C и титруют при этой температуре 0,1 М раствором натрия эдетата до перехода фиолетовой окраски раствора в синюю.

1 мл 0,1 М раствора натрия эдетата соответствует 2,431 мг Mg.

# Допускается проводить определение магния по следующей методике:

Точную навеску испытуемого вещества, эквивалентную 0,02-0,03 г магния, растворяют, как указано в частной статье. Прибавляют 50 мл воды Р, 10 мл буферного раствора с рН 9,5-10,0; 0,1 г индикаторной смеси протравного черного 11 Р (эриохром черный Т) или 7 капель раствора протравного черного 11 Р

(эриохром черный Т) и титруют 0,05 М раствором натрия эдетата до синего

окрашивания.

1 мл 0,05 М раствора натрия эдетата соответствует 1,215 мг Mg.

СВИНЕЦ

Раствор, указанный в частной статье, помещают в коническую колбу

вместимостью 500 мл и доводят объем раствора водой Р до 200 мл. Прибавляют около 50 мг индикаторной смеси ксиленолового оранжевого Р, а затем

гексаметилентетрамина Р до появления фиолетово-розовой окраски раствора. Затем титруют 0,1 М раствором натрия эдетата до перехода фиолетово-розовой окраски раствора в желтую.

1 мл 0,1 М раствора натрия эдетата соответствует 20,72 мг Pb.

ЦИНК

Раствор, указанный в частной статье, помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл и доводят объем раствора водой Р до 200 мл. Прибавляют

около 50 мг индикаторной смеси ксиленолового оранжевого Р, а затем

гексаметилентетрамина Р до появления фиолетово-розовой окраски раствора. После этого дополнительно прибавляют 2 г гексаметилентетрамина Р и титруют

0,1 М раствором натрия эдетата до перехода фиолетово-розовой окраски раствора в желтую.

1 мл 0,1 М раствора натрия эдетата соответствует 6,54 мг Zn.

2.5.12. ВОДА: ПОЛУМИКРОМЕТОД (#Метод К.Фишера)

Для титрования используют сосуд вместимостью 60 мл, снабженный двумя платиновыми электродами, трубкой для подвода азота, пробкой, в которую вставляется конец бюретки, и трубкой, заполненной осушающим агентом.

Испытуемое вещество вносят в сосуд через трубку, расположенную с противоположной стороны по отношению к трубке-осушителю, которая должна

закрываться притертой пробкой. В процессе титрования раствор перемешивают с

помощью магнитной мешалки или посредством продувания высушенного азота через раствор.

Конечную точку титрования обнаруживают амперометрически. Электрическая схема состоит из потенциометра с сопротивлением около 2000 Ом, подключенного к

источнику постоянного тока с напряжением 1,5 В, который обеспечивает необходимую разность потенциалов. Разность потенциалов отрегулирована таким

образом, чтобы через платиновые электроды, соединенные последовательно с микроамперметром, проходил небольшой начальный ток. При прибавлении реактива стрелка микроамперметра отклоняется, но сразу же возвращается в исходное положение. В конце реакции полученное отклонение должно быть неизменным в

течение 30 с.

Иодсернистый реактив Р (реактив К.Фишера) используют после определения его титра по воде (4.1.1). Используемые реактивы и растворы должны быть безводными; необходимо принять меры предосторожности для исключения воздействия на них атмосферной влаги. Йодсернистый реактив Р необходимо

беречь от света и желательно хранить в емкости, снабженной автоматической

бюреткой.

#Допускается использование йодсернистого реактива, выпускаемого

отечественными и зарубежными предприятиями в соответствии с требованиями

технических нормативных правовых актов, утвержденных в установленном порядке.

#Йодсернистый реактив представляет собой раствор серы диоксида, йода и пиридина в метаноле. Взаимодействие реактива с водой протекает стехиометрически по уравнениям:

I2 + SO2 + H2O + 3C5H5N → 2C5H5N·HI + C5H5NSO3

C5H5NSO3 + CH3OH → C5H5N·HSO4CH3

#Иодсернистый реактив, указанного выше состава, неприменим для анализа

соединений, реагирующих с одним или несколькими компонентами реактива, как, например, аскорбиновая кислота, меркаптаны, сульфиды, гидрокарбонаты и

карбонаты щелочных металлов, альдегиды, кетоны и др.

#При определении воды в твердых веществах, нерастворимых в метаноле,

тонко измельченную навеску вещества взбалтывают с метанолом, после чего

титруют йодсернистым реактивом. Некоторые вещества или смеси можно

растворять в безводных уксусной кислоте, хлороформе, пиридине и других растворителях.

Имеющиеся в продаже йодсернистые реактивы часто отличаются по

составу от йодсернистого реактива Р: в них пиридин заменен на другие основания. Использование таких реактивов необходимо предварительно

валидировать с целью подтверждения в каждом конкретном случае,

стехиометрии и отсутствия несовместимости между испытуемым веществом и реактивом (1.1 Общие замечания).

Если нет других указаний в частной статье, используют метод А.

МЕТОД А

Около 20 мл метанола безводного Р или растворителя, указанного в частной статье, помещают в сосуд для титрования и титруют иодсернистым реактивом Р, обнаруживая конечную точку титрования амперометрически. Указанное количество

испытуемого вещества быстро помещают в сосуд для титрования. Смесь перемешивают в течение 1 мин и снова титруют йодсернистым реактивом Р,

обнаруживая конечную точку титрования амперометрически.

МЕТОД B

Около 10 мл метанола безводного Р или растворителя, указанного в частной статье, помещают в сосуд для титрования и титруют йодсернистым реактивом Р, обнаруживая конечную точку титрования амперометрически.

Затем быстро вносят в сосуд для титрования указанное количество

испытуемого вещества и точно измеренный объем йодсернистого реактива Р,

взятого в избытке приблизительно на 1 мл или объем, указанный в частной статье. Сосуд закрывают пробкой, выдерживают в защищенном от света месте в течении 1 мин или в течение времени, указанного в частной статье, периодически перемешивая содержимое сосуда. Избыток йодсернистого реактива Р титруют до

первоначального значения силы тока, используя метанол безводный Р или

растворитель, указанный в частной статье, к которому было прибавлено точно известное количество воды Р, эквивалентное около 2,5 г/л.

# Конечную точку титрования допускается обнаруживать визуально по изменению окраски титруемой жидкости от желтой до красновато-коричневой при условии обеспечения необходимой точности.

2.5.13. АЛЮМИНИЙ В АДСОРБИРОВАННЫХ ВАКЦИНАХ

Испытуемое вещество гомогенизируют и переносят соответствующее количество, содержащее от 5 мг до 6 мг алюминия, в колбу для сжигания вместимостью 50 мл. Прибавляют 1 мл серной кислоты Р, 0,1 мл азотной кислоты

Р и несколько стеклянных шариков. Нагревают полученный раствор до его помутнения из-за выделяющегося белого дыма. Если на данной стадии

наблюдается обугливание, прибавляют несколько капель азотной кислоты Р и продолжают кипячение до исчезновение окраски. Смесь охлаждают несколько минут, с осторожностью добавляют 10 мл воды Р и кипятят до получения

прозрачного раствора. Охлаждают, прибавляют 0,05 мл метилового оранжевого

раствор Р и нейтрализуют натрия гидроксида раствором концентрированным Р

(6,5 мл на 7 мл). Если образуется осадок, его растворяют, добавляя по каплям достаточный объем серной кислоты разведенной Р. Переносят раствор в

коническую колбу вместимостью 250 мл, остатки в колбе для сжигания смывают 25

мл воды Р. Прибавляют 25,0 мл 0,02 М раствора натрия эдетата, 10 мл ацетатного буферного раствора рН 4,4 Р, несколько стеклянных шариков и

осторожно кипятят в течение 3 мин, добавляют 0,1 мл пиридилазонафтола раствор Р и титруют горячий раствор 0,02 М раствором меди сульфата до изменения цвета

раствора на пурпурно-коричневый.

Испытания повторяют без использования вакцины.

1 мл 0,02 М раствора натрия эдетата соответствует 0,5396 мг Al.

2.5.14. КАЛЬЦИЙ В АДСОРБИРОВАННЫХ ВАКЦИНАХ

Все растворы, используемые для данного исследования должны готовится

с использованием воды Р .

Кальций определяют атомно-эмиссионной спектрометрией (2.2.22, метод 1). Исследуемое лекарственное средство гомогенизируют. К 1,0 мл прибавляют 0,2 мл

кислоты хлористоводородной разведенной Р и разводят до 3,0 мл водой Р.

Измеряют интенсивность излучения при длине волны 620 нм.

2.5.15. ФЕНОЛ В ИММУНОСЫВОРОТКАХ И ВАКЦИНАХ

Исследуемое лекарственное средство гомогенизируют. Разводят до необходимого объема водой Р, чтобы получить раствор, содержащий 15 мкг/мл фенола. Готовят ряд стандартных растворов с фенолом Р, содержащих 5 мкг, 10

мкг, 15 мкг, 20 мкг и 30 мкг/мл фенола соответственно. К 5 мл исследуемого

раствора и к 5 мл каждого стандартного раствора прибавляют 5 мл буферного раствора рН 9,0 Р, 5 мл раствора 1 г/л аминопиразолона Р и 5 мл раствора 50г/л

калия ферроцианида Р. Дают отстояться 10 мин и измеряют интенсивность окрашивания при длине волны 546 нм.

Строят градуировочный график и рассчитывают содержание фенола в

лекарственном средстве.

2.5.16. БЕЛОК В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ

Исследуемый раствор. Используют мерную колбу необходимого объема для приготовления раствора, содержащего около 5 мг/мл сухого полисахарида.

Количественно переносят содержимое контейнера в колбу и разводят до объема водой Р. Помещают 1 мл раствора в стеклянную пробирку и добавляют 0,15 мл раствора 400 г/л кислоты трихлоруксусной Р. Встряхивают, дают отстояться 15 мин, центрифугируют в течение 10 мин при скорости вращения 5000 об/мин и

удаляют надосадочную жидкость. К полученному осадку добавляют 0,4 мл 0,1 M

раствора натрия гидроксида Р.

Стандартные растворы. Разводят 0,100 г альбумина бычьего Р в 100 мл 0,1 M натрия гидроксида (основной раствор, содержащий 1 г/л белка). Разводят 1 мл

основного раствора до 20 мл 0,1 M раствором натрия гидроксида Р (рабочий раствор 1 с концентрацией белка 50 мг/л). Разводят 1 мл основного раствора до 4

мл 0,1 M раствором натрия гидроксида Р (рабочий раствор 2 с концентрацией

протеина 250 мг/л). В 6 стеклянных пробирок помещают 0,10 мл, 0,20 мл и 0,40 мл рабочего раствора 1 и 0,15 мл, 0,20 мл и 0.25 мл рабочего раствора 2. доводят объем в каждой пробирке до 0,40 мл, используя 0,1 M раствор натрия гидроксида Р.

Готовят контрольный раствор, используя 0,40 мл 0,1 M раствор натрия

гидроксида Р

В каждую пробирку добавляют 2 мл раствора медно-тартратногоо Р встряхивают и дают отстояться в течение 10 мин. В каждую пробирку добавляют по

0,2 мл смеси равных объемов фосфомолибденовольфрамового реактива Р и воды

Р, приготовленной непосредственно перед использованием. Закрывают пробирки, перемешивают, переворачивают их и дают отстояться в темном месте в течение 30

мин. Голубой цвет остается стабильным в течение 60 мин. При необходимости центрифугируют для получения прозрачных растворов.

Измеряют оптическую плотность (2.2.25) каждого раствора при длине волны

760 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения. Строят градуировочный график на основе оптической плотности 6 стандартных растворов и

соответствующей концентрации белка и сравнивают с графиком показателей белка в исследуемом растворе.

2.5.17. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ

Исследуемый раствор. Для приготовления раствора, содержащего около 5 мг/мл сухого полисахарида, используют мерную колбу необходимого объема

Количественно переносят содержимое контейнера в колбу и разводят до необходимого объема водой Р. При необходимости разводят исследуемый раствор

до достижения оптической плотности, подходящей к используемому прибору. Измеряют оптическую плотность (2.2.25) при длине волны 260 нм, используя воду Р

в качестве раствора сравнения.

Оптическая плотность раствора 1 г/л нуклеиновой кислоты при длине волны 260 нм равна 20.

2.5.18. ФОСФОР В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ

Исследуемый раствор. Для приготовления раствора, содержащего около 5

мг/мл сухого полисахарида, используют мерную колбу необходимого объема.

Количественно переносят содержимое контейнера в колбу и разводят до объема водой Р. Разводят раствор так, чтобы объем, используемый в опыте (1 мл), содержал около 6 мкг фосфора. Переносят 1,0 мл раствора в пробирку на 10 мл из термостойкого стекла.

Стандартные растворы. 0,2194 г калия дигидрофосфата Р разводят в 500

мл воды Р таким образом, чтобы концентрация раствора была равна 0,1 мг/мл

фосфора. 5,0 мл раствора разводят до 100,0 мл водой Р. Переносят 0,5 мл, 1,0 мл и

2,0 мл разведенного раствора в три пробирки из термостойкого стекла. Готовят контрольный раствор, используя 2,0 мл воды Р в пробирке из термостойкого стекла.

Во все пробирки добавляют 0,2 мл кислоты серной Р и подогревают на

масляной бане при 120 C в течение 1 ч, а затем при 160 C до появления белого

дыма (около 1 ч). Прибавляют 0,1 мл кислоты хлорной Р и нагревают при 160°C до обесцвечивания раствора (около 90 мин). Охлаждают и прибавляют в каждую

пробирку 4 мл воды очищенной и 4 мл реактива аммония молибдата Р. Нагревают на водяной бане при 37 C в течение 90 мин и охлаждают. Доводят объем до 10,0 мл с помощью воды Р. Голубой цвет остается стабильным в течение нескольких часов.

Измеряют оптическую плотность (2.2.25) каждого раствора при длине волны

820 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения. Строят

градуировочный график на основе оптической плотности трех стандартных растворов и соответствующей концентрации фосфора и сравнивают с оптической

плотностью исследуемого раствора.

2.5.19. O-АЦЕТИЛ В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ

Исследуемый раствор. Для приготовления раствора, содержащего около 5 мг/мл сухого полисахарида, используют мерную колбу необходимого объема.

Количественно переносят содержимое контейнера в колбу и разводят до

необходимого объема водой Р. Раствор разводят так, чтобы объемы, используемые в опыте, содержали от 30 мкг до 600 мкг ацетилхолин хлорида (O-ацетил).

Помещают 0,3 мл, 0,5 мл и 1,0 мл по два раза в 6 пробирок (3 реагирующих раствора и 3 корректирующих раствора).

Стандартные растворы. Растворяют 0,150 г ацетилхолин хлорида Р в 10 мл

воды Р (основной раствор, содержащий 15 г/л ацетилхолин хлорида). Непосредственно перед использованием разводят 1 мл основного раствора до 50 мл

водой Р (рабочая концентрация 1 – 300 мкг/мл ацетилхолин хлорида). Непосредственно перед использованием разводят 1 мл основного раствора до 25 мл водой Р (рабочая концентрация 2 – 600 мкг/мл ацетилхолин хлорида). Помещают 0,1

мл и 0,4 мл рабочей концентрации 1 дважды (реагирующий и корректирующий растворы) в 4 пробирки и 0,6 мл и1,0 мл рабочей концентрации 2 дважды

(реагирующий и корректирующий растворы) в другие 4 пробирки. Готовят контрольный раствор, используя 1 мл воды Р.

Доводят объем в каждой пробирке до 1 мл водой Р. Добавляют 1,0 мл 4 М

раствора кислоты хлористоводородной в каждую из корректирующих пробирок и в контрольную пробу. Добавляют 2,0 мл щелочного раствора гидроксиламина Р в

каждую пробирку. Дают пройти реакции в течение 2 мин и добавляют в каждую из пробирок с реагирующим раствором 1 мл 4 М раствора кислоты

хлористоводородной. Прибавляют 1,0 мл раствора 100 г/л железа хлорида Р в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной в каждую пробирку, закрывают пробирки пробками и сильно встряхивают для удаления пузырьков.

Измеряют оптическую плотность (2.2.25) каждого раствора при длине волны

540 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения. Для каждого

реагирующего раствора вычитают оптическую плотность соответствующего корректирующего раствора. Строят градуировочный график на основании

скорректированных оптических плотностей для 4 стандартных растворов и

соответствующего содержания ацетилхолин хлорида и сравнивают с графиком содержание ацетилхолин хлорида в исследуемом растворе для каждого исследуемого объема. Рассчитывают среднее по трем величинам.

1 моль ацетилхолин хлорида (181,7 г) соответствует 1 молю O-ацетила (43,05

г).

2.5.20. ГЕКСОЗАМИНЫ В ПОЛИСАХАРИДНЫХ ВАКЦИНАХ

Исследуемый раствор. Для приготовления раствора, содержащего около 5

мг/мл сухого полисахарида, используют мерную колбу необходимого объема.

Количественно переносят содержимое контейнера в колбу и разводят до объема

водой Р. Раствор разводят таким образом, чтобы объемы, используемые для опыта, содержали от 125 мкг до 500 мкг глюкозамина (гексозамина). В градуированную

пробирку вносят 1,0 мл разведенного раствора.

Стандартные растворы. 60 мг глюкозамин гидрохлорида Р растворяют в

100 мл воды Р (основной раствор, содержащий 0,500 г/л глюкозамина). Помещают 0,25 мл, 0,50 мл, 0,75 мл, и 1,0 мл рабочей концентрации в 4 градуированные

пробирки.

Готовят контрольную пробу, используя 1 мл воды Р.

Доводят объем в каждой пробирке до 1 мл водой Р. В каждую пробирку

прибавляют 1 мл (292 г/л) раствора кислоты хлористоводородной Р. Закрывают

пробирки пробками и помещают в водяную баню на 1 ч. Охлаждают до комнатной температуры. В каждую пробирку добавляют 0,05 мл (5 г/л) раствора

тимолфталеина Р в спирте Р. Прибавляют раствор 200 г/л натрия гидроксида Р

до голубого окрашивания, а затем раствор 1 М кислоты хлористоводородной до