биохимия (Восстановлен)

дефосфорилированием дУДФ;

гидролитическим дезаминированием дЦМФ с помощью дЦМФ дезаминазы. дЦМФ получается при дефосфорилировании дЦДФ - одного из продуктов рибонуклеотидредуктазной реакции. В организме человека это основной путь образования дУМФ.

Скорость синтеза дТМФ зависит также от количества второго субстрата тимидилатсинтазной реакции - N5,N10-метилен-Н4-фолата, пополнение запасов которого осуществляется при участии 2 ферментов: дигидрофолатредуктазы, которая с участием NADPH восстанавливает Н2-фолат в Н4-фолат, и серии гидроксиметилтрансферазы, осуществляющей перенос β-гидроксиметиленовой группы серина на Н4-фолат. У человека дТМФ образуется, главным образом, из дЦДФ.

Регуляция синтеза дезоксирибонуклеотидов

Рибонуклеотидредуктаза, тимидилатсинтаза и тимидинкиназа - индуцируемые ферменты, их количество в клетке регулируется на генетическом уровне по механизму индукции и репрессии. Синтез этих белков начинает нарастать в G1-периоде, достигает максимума во время активного синтеза ДНК, снижаясь практически до нуля в G2- и М-периоды клеточного цикла.

В то же время активность РНР подвержена сложной аллостерической регуляции, с помощью которой достигается сбалансированное образование всех дНДФ.

РНР осуществляет последовательное восстановление всех рибонуклеозиддифосфатов. Первыми восстанавливаются пиримидиновые нуклеотиды, а последним - дАДФ. дАДФ фосфорилируется в дАТФ, накопление которого полностью прекращает восстановление всех остальных рибонуклеозиддифосфатов.

В терапии инфекционных и онкологических болезней, научных исследованиях в области медицины и биологии часто используют синтетические аналоги пуринов и пиримидинов. Введение в организм животного или человека аналога, имеющего изменения в структуре гетероциклического кольца или углеводной компоненты, угнетает активность ферментов, участвующих в метаболизме нуклеотидов, скорость синтеза РНК или ДНК из-за нарушения комплементарных взаимодействий азотистых оснований и роста полинуклеотидных цепей. Аналоги пуринов, пиримидинов и их нуклеозиды нашли применение в качестве антибактериальных, противовирусных и химиотерапевтических средств.

А. Противоопухолевые препараты

Синтезировано очень много аналогов дНТФ, которые включаются ДНК полимеразами в ДНК и ингибируют репликацию. К числу мощных противоопухолевых препаратов принадлежит 5-фторурацил (5- FU) - аналог урацила.

Цитозинарабинозид (или цитарабин) представляет собой соединение, в котором остаток рибозы замещѐн на стериоизомер - арабинозу. Оно используется в химиотерапии рака, в частности, при острой миелоцитарной лейкемии.

В организме препарат может превращаться в дНТФ, ингибировать ДНК полимеразы и снижать скорость репликации.

Аналоги фолиевой кислоты. В обмене нуклеотидов производные Н4-фолата как доноры одноуглеродных групп участвуют в формировании пуринового гетероциклического кольца и в ключевой реакции синтеза дТМФ из дУМФ, катализируемой тимидилатсинтазой.

В последнем случае N5,N10-метилен-Н4-фолат служит донором метальной группы и в ходе реакции превращается в Н2-фолат. Для активного синтеза тимидиловых нуклеотидов Н2-фолат должен повторно использоваться, проходя стадию восстановления в Н4-фолат .

Метотрексат и аминоптерин - структурные аналоги фолиевой кислоты - ингибируют дигидрофолатредуктазу и таким образом нарушают синтез пуриновых нуклеотидов и превращение дУМФ в дТМФ, снижая внутриклеточную концентрацию субстратов синтеза ДНК и РНК. Препараты широко используют в химиотерапии опухолей.

Б. Антивирусные и антибактериальные препараты

Азидотимидин (AZT, или зидовидин) представляет собой мощный противовирусный препарат, применяющийся в лечении инфекций, которые сопровождают приобретѐнные формы иммунодефицита. Будучи структурным аналогом тимид-на, препарат имеет в З'-положении дезоксирибозы азидогруппу .

AZT может фосфорилироваться и с помощью ДНК-полимераз включаться в растущую молекулу ДНК. Однако присутствие в 3'-положении дезоксирибозы азидогруппы делает синтезирующиеся молекулы ДНК не способными к последующему удлинению. В результате образование новых молекул ДНК прекращается.

Важно, что фосфорилированные производные AZT утилизируются более эффективно вирусной ДНКполимеразой или так называемой обратной транскриптазой, чем ДНК-полимеразами эукариотов, поэтому препарат наиболее эффективно влияет на размножение вирусов и, в частности, ретровируса, вызывающего ВИЧ-инфекцию.

5-йоддезоксиуридин используют в терапии кератитов и поражений роговицы глаза вирусом герпеса.

Азатиоприн в организме превращается в 6-меркаптопурин, который оказывает мощное иммуносупрессорное действие. Препарат широко используют в трансплантологии для предотвращения развития иммунологических реакций, вызывающих отторжение трансплантата.

27. Азотистые основания, входящие в структуру нуклеиновых кислот – пуриновые и пиримидиновые. Нуклеотиды, содержащие рибозу и дезоксирибозу. Структура. Номенклатура.

27. Первичная структура нуклеиновых кислот. ДНК и РНК–черты сходства и различия состава, локализации в клетке, функции. Вторичная структура ДНК (модель Уотсона и Крика). Связи, стабилизирующие вторичную структуру ДНК. Комплементарность. Правило Чаргаффа. Полярность. Антипараллельность.

Первичная структура ДНК - порядок чередования дезоксирибонуклеозидмонофосфатов (дНМФ) в полинукпеотидной цепи.

Каждая фосфатная группа в полинукпеотидной цепи, за исключением фосфорного остатка на 5'-конце молекулы, участвует в образовании двух эфирных связей с участием 3'- и 5'-углеродных атомов двух соседних дезоксирибоз, поэтому связь между мономерами обозначают 3', 5'-фосфодиэфирной.

Концевые нуклеотиды ДНК различают по структуре: на 5'-конце находится фосфатная группа, а на 3'- конце цепи - свободная ОН-группа. Эти концы называют 5'- и 3'-концами. Линейная последовательность дезоксирибонуклеотидов в полимерной цепи ДНК обычно сокращѐнно записывают с помощью однобуквенного кода, например -A-G-C-T-T-A-C-A- от 5'- к 3'-концу.

В каждом мономере нуклеиновой кислоты присутствует остаток фосфорной кислоты. При рН 7 фосфатная группа полностью ионизирована, поэтому in vivo нуклеиновые кислоты существуют в виде полианионов (имеют множественный отрицательный заряд). Остатки пентоз тоже проявляют гидрофильные свойства. Азотистые основания почти нерастворимы в воде, но некоторые атомы пуринового и пиримидинового циклов способны образовывать водородные связи.

Первичная структура РНК - порядок чередования рибонуклеозидмонофосфатов (НМФ) в полинуклеотидной

Концы полинуклеотидных цепей РНК неодинаковы. На одном конце находится фосфорилированная ОН-группа 5'-углеродного атома, на другом конце - ОН-группа 3'-углеродного атома рибозы, поэтому концы называют 5'- и 3'-концами цепи РНК. Гидроксильная группа у 2'-углеродного атома рибозы делает молекулу РНК нестабильной. Так, в слабощелочной среде молекулы РНК гидролизуются даже при нормальной температуре, тогда как структура цепи ДНК не изменяется.

Признаки	ДНК		РНК
Местонахождение в клетке	Ядро, митохондрии,		Ядро, рибосомы, цитоплазмы,
	хлоропласты		митохондрии, хролопласты
Местонахождение в ядре	Хромосомы		Ядрышко
Строение макромолекулы	Двойной неразветвленный		Одинарная полинуклеотидная
	линейный полимер, свернутый		цепочка
	правозакрученной спиралью
Мономеры	Дезоксирибонуклеотиды		Рибонуклеотиды
Состав нуклеотид а	Азонистое основание		Азонистое основание (пуриновое-
	(пуриновое-аденин, гуанин,		аденин, гуанин, пиримидиновое-
	пиримидиновое –		урацил, цитозин);рибоза
	тимин, цитозин);		(углевод); остаток фосфорной
	дезоксирибоза (углевод);		кислоты
	остаток фосфорной кислоты
Типы нуклеидов	Адениловый (А),		Адениловый (А), гуаниловый (Г),
	гуаниловый(Г), тимидиловый		уридиловый (Т),цитидиловый (Ц)
	(Т), цитидиловый (Ц)

Свойства	Способная к самоудвоению по		Не способна к самоудвоению.
	принципу комплементарности		Лабильна.
	А=Т, Т=А, Г=Ц, Ц=Г
	Стабильна.
Функции	Химическая основа		Информационная (иРНК) –
	хромосомного генетического		передает код наследственной
	материала (гена); синтез ДНК,		информации о первичной
	синтез РНК, информация о		структуре белковой молекулы,
	структуре белков.		рибосомальная (рРНК) – входит в
			состав рибосом; транспортная
			(тРНК) – переносит аминокислоты
			к рибосомам; митохондриальная и
			платидная РНК – входят в состав
			рибосом этих органелл

Вторичная структура ДНК. В 1953 г. Дж. Уотсоном и Ф. Криком была предложена модель пространственной структуры ДНК. Согласно этой модели, молекула ДНК имеет форму спирали, образованную двумя полинуклеотидными цепями, закрученными относительно друг друга и вокруг общей оси. Двойная спираль правозакрученная, полинуклеотидньхе цепи в ней антипараллельны, т.е. если одна из них ориентирована в направлении 3'→5', то вторая - в направлении 5'→3'. Поэтому на каждом из концов

Все основания цепей ДНК расположены внутри двойной спирали, а пентозофосфатный остов - снаружи. Полинуклеотидные цепи удерживаются относительно друг друга за счѐт водородных связей между комплементарными пуриновыми и пиримидиновыми азотистыми основаниями А и Т (две связи) и между G и С (три связи). При таком сочетании каждая пара содержит по три кольца, поэтому общий размер этих пар оснований одинаков по всей длине молекулы. Водородные связи при других сочетаниях оснований в паре возможны, но они значительно слабее. Последовательность нуклеотидов одной цепи полностью комплементарна последовательности нуклеотидов второй цепи. Поэтому, согласно правилу Чаргаффа (Эрвин Чаргафф в 1951 г. установил закономерности в соотношении пуриновых и пиримидиновых оснований в молекуле ДНК), число пуриновых оснований (А + G) равно числу пиримидиновых оснований

(Т + С).

Комплементарые основания уложены в стопку в сердцевине спирали. Между основаниями двухцепочечной молекулы в стопке возникают гидрофобные взаимодействия, стабилизирующие двойную спираль.

Такая структура исключает контакт азотистых остатков с водой, но стопка оснований не может быть абсолютно вертикальной. Пары оснований слегка смещены относительно друг друга. В образованной структуре различают две бороздки - большую, шириной 2,2 нм, и малую, шириной 1,2 нм. Азотистые основания в области большой и малой бороздок взаимодействуют со специфическими белками, участвующими в организации структуры хроматина.

27. Гибридизация нуклеиновых кислот. Денатурация и ренативация ДНК. Гибридизация (ДНКДНК, ДНК-РНК). Методы лабораторной диагностики, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот.(ПЦР)

На явлении денатурации и ренативации основан метод, называемый "молекулярная гибридизация". Процесс гибридизации может осуществляться между двумя любыми цепями нуклеиновых кислот (ДНК-ДНК, ДНК-РНК) при условии, что они содержат комплементарные последовательности нуклеотидов. Такие гибридные структуры можно выделить центрифугированием в градиенте плотности сахарозы или наблюдать в электронном микроскопе .

Если раствор, содержащий образцы ДНК 1 и 2, выделенные из организмов разных видов, денатурировать, а затем провести ренатива-цию, то образуются двухспиральные структуры. Но наряду с исходными ДНК 1 и

ДНК 2 образуются гибридные двойные спирали, содержащие цепь ДНК образца 1 и цепь ДНК образца 2, где присутствуют как спирализованные, так и неспирализованные участки. В неспирализованных участках фрагменты цепей ДНК не комплементарны, т.е. в ходе гибридизации получаются несовершенные гибриды. Методом молекулярной гибридизации можно установить:

сходство и различие первичной структуры разных образцов нуклеиновых кислот;

различие ДНК, выделенных из организмов разных видов;

идентичность ДНК всех органов и тканей одного организма.

При проведении гибридизации ДНК-РНК были выделены гибридные молекулы, содержащие одну цепь ДНК и одну цепь РНК. Если для эксперимента были взяты ДНК и РНК (первичный транскрипт), выделенные из одного организма, то образовывались совершенные гибриды, потому что молекула РНК комплементарна цепи ДНК. Гибридизацией ДНК-РНК было впервые установлено, что все виды РНК клетки имеют на молекуле ДНК комплементарные участки.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), предложенный в 1983 г. Карри Муллисом (Нобелевская премия, 1993 г.), явился эпохальным открытием XX века в области молекулярной биологии. Он позволяет подвергать специфичной амплификации в условиях in vitro (в пробирке) участки ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые образцы ДНК. Необходимое условие для проведения ПЦР - знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области. Участок исследуемой ДНК гибридизуют с двумя искусственно синтезированными праймерами - олигодезоксирибонуклеотидными последовательностями длиной от 15 до 30 пар нуклеотидов, которые комплементарны 3'-концам амплифицируемого участка на кодирующей и некодирующей нитях ДНК. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул. В качестве матрицы для синтеза продуктов ПЦР используют любой тип ДНК: геномную ДНК человека, различных видов про- и эукариотов, ДНК, выделенную из культур клеток, "библиотек" генов и других источников. Метод не требует больших количеств исследуемой ДНК, в принципе, достаточно даже одной молекулы, содержащейся в одном волосе на голове, одной капле крови или спермы.

Успех в разработке метода в значительной степени обусловлен использованием в качестве фермента термофильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и потому устойчивой к действию высоких температур.

Реакционная смесь для получения интересующей нас ДНК содержит исследуемую ДНК, субстраты реакции - 4 дНТФ, 2 праймера, термостабильную, или Taq-полимеразу и буфер, содержащий ионы Mg2+.

Один цикл полимеризации включает 3 этапа (рис. 4-67):

плавление: на этой стадии реакционную смесь нагревают до температуры 90-97 °С. Исследуемая двуцепочечная ДНК денатурирует и переходит в однонитевую форму;

гибридизация или отжиг ДНК с праймерами. В результате снижения температуры до 5060 °С происходит комплементарное связывание праймеров с цепями матричной ДНК и образование двухцепочечного участка на каждой из нитей ДНК;

элонгация, удлинение нитей ДНК, комплементарных матричной ДНК, катализирует Taq-полимераза в направлении от 5'- к 3'-концу.

Затем снова наступает этап плавления, когда за счѐт повышения температуры синтез ДНК прекращается, и двунитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК денатурирует. Во втором и последующих циклах праймеры гибридизируются с исходной матричной ДНК и с вновь синтезированными молекулами ДНК, количество которых нарастает в геометрической прогрессии. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не из-за изменения температурного режима, а по достижении ДНК-полиМеразой границы амплифицированного участка, что определяет строго определѐнный размер продукта с точностью до одного нуклеотида.

Каждый из этапов цикла имеет продолжительность от десятков секунд до 1-3 мин, в результате полный цикл длится от одной до нескольких минут.

Описанную процедуру амплификации ДНК проводят в автоматическом режиме в приборе - циклизаторе, или термоциклере, амплификаторе ДНК. Такой прибор позволяет задавать нужное количество

циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры. За 25-30 циклов число синтезированных копий ДНК достигает нескольких миллионов.

С помощью ПЦР можно получить достаточное количество копий участков ДНК, в которых предполагаются присутствие мутаций, полиморфизм сайтов, можно проводить ДНК-диагностику инфицированности пациентов вирусными, бактериальными и грибковыми возбудителями болезней.

28. Третичная структура ДНК. Роль гистоновых и негистоновых белков в компактизации ДНК. Организация хроматина. Ковалентная модификация гистонов и ее роль в регуляции структуры и активности хроматина.

Каждая молекула ДНК упакована в отдельную хромосому. В диплоидных клетках человека содержится 46 хромосом. Общая длина ДНК всех хромосом клетки составляет 1,74 м, но она упакована в ядре, диаметр которого в миллионы раз меньше. Чтобы расположить ДНК в ядре клетки, должна быть сформирована очень компактная структура. Компактизация и суперспирализация ДНК осуществляются с помощью разнообразных белков, взаимодействующих с определѐнными последовательностями в структуре ДНК. Все связывающиеся с ДНК эукариотов белки можно разделить на 2 группы: гисгоновые и негистоновые белки. Комплекс белков с ядерной ДНК клеток называют хроматином.

Гистоны - белки с молекулярной массой 11-21 кД, содержащие много остатков аргинина и лизина. Благодаря положительному заряду гистоны образуют ионные связи с отрицательно заряженными фосфатными группами, расположенными на внешней стороне двойной спирали ДНК.

Существует 5 типов гистонов. Четыре гистона Н2А, Н2В, НЗ и Н4 образуют октамерный белковый комплекс (Н2А, Н2В, НЗ, Н4)2, который называют "нуклеосомный кор" (от англ.nucleosome core). Молекула ДНК "накручивается" на поверхность гистонового октамера, совершая 1,75 оборота (около 146 пар нуклеоти-дов). Такой комплекс гистоновых белков с ДНК служит основной структурной единицей хроматина, еѐ называют "нуклеосома". ДНК, связывающую нуклеосомные частицы, называют линкерной ДНК. В среднем линкерная ДНК составляет 60 пар нуклеотидных остатков. Молекулы гистона H1 связываются с ДНК в межнуклеосомных участках (линкерных последовательностях) и защищают эти участки от действия нуклеаз .

В ядре каждой клетки присутствует около 60 млн молекул каждого типа гистонов, а общая масса гистонов примерно равна содержанию ДНК. Аминокислотные остатки лизина, аргинина и концевые аминогруппы гистонов могут модифицироваться: ацетилироваться, фосфорилироваться, метилироваться или взаимодействовать с белком убиквитином (негистоновый белок). Модификации бывают обратимыми и необратимыми, они изменяют заряд и конформацию гистонов, а это влияет на взаимодействие гистонов между собой и с ДНК. Активность ферментов, ответственных за модификации, регулируется и зависит от стадии клеточного цикла. Модификации делают возможными конформационные перестройки хроматина.

Негистоновые белки хроматина

В ядре эукариотической клетки присутствуют сотни самых разнообразных ДНК-связывающих негистоновых белков. Каждый белок комплементарен определѐнной последовательности нуклеотидов ДНК (сайт ДНК). К этой группе относят семейство сайт-специфических белков типа "цинковые пальцы". Каждый "цинковый палец" узнаѐт определѐнный сайт, состоящий из 5 нуклеотидных пар. Другое семейство сайт-специфических белков - гомодимеры. Фрагмент такого белка, контактирующий с ДНК, имеет структуру "спираль-поворот-спираль". К группе структурных и регуляторных белков, которые постоянно ассоциированы с хроматином, относят белки высокой подвижности (HMG-белки - от англ, high mobility gel proteins). Они имеют молекулярную массу менее 30 кД и характеризуются высоким содержанием заряженных аминокислот. Благодаря небольшой молекулярной массе HMG-белки обладают высокой подвижностью при электрофорезе в полиакриламидном геле. К негистоновым белкам принадлежат также ферменты репликации, транскрипции и репарации. При участии структурных, регуляторных белков и ферментов, участвующих в синтезе ДНК и РНК, нить нуклеосом преобразуется в высококонденсированный комплекс белков и ДНК. Образованная структура в 10 000 раз короче исходной молекулы ДНК.

29. Репликация. Принципы репликации ДНК. Стадии репликации. Инициация. Белки и ферменты, принимающие участие в формировании репликативной вилки.

Живые организмы в течение S-фазы клеточного цикла, которая предшествует делению клетки, удваивают содержание ДНК таким образом, что каждая дочерняя клетка после деления получает набор

хромосом, идентичный родительской клетке. Процесс удвоения хромосом называют репликацией (редупликацией).

Хромосома содержит одну непрерывную двухцепочечную молекулу ДНК. При репликации каждая цепь родительской двухцепочечной ДНК служит матрицей для синтеза новой комплементарной цепи. Вновь образованная двойная спираль имеет одну исходную (родительскую) и одну вновь синтезированную (дочернюю) цепь. Такой механизм удвоения ДНК получил название"полуконсервативная репликация" (рис. 4-14). Первичная структура дочерней цепи определяется первичной структурой родительской цепи, потому что в основе еѐ образования лежит принцип комплементарности оснований (G ≡ С и А = Т).

Ферменты и белки, участвующие в репликации, должны работать быстро и точно. Эти условия выполняются с помощью особого мультиферментного комплекса.

Репликацию можно разделить на 4 этапа: образование репликативной вилки (инициация), синтез новых цепей (элонгация), исключение праймеров, завершение синтеза двух дочерних цепей ДНК (терминация).

А. Инициация репликации

Синтез ДНК у эукариотов происходит в S-фазу клеточного цикла. Инициацию репликации регулируют специфические сигнальные белковые молекулы - факторы роста. Факторы роста связываются рецепторами мембран клеток, которые передают сигнал, побуждающий клетку к началу репликации .

Синтез новых одноцепочечных молекул ДНК может произойти только при расхождении родительских цепей. В определѐнном сайте (точка начала репликации) происходит локальная денатурация ДНК, цепи расходятся и образуются две репликативные вилки, движущиеся в противоположных направлениях.

В образовании репликативной вилки принимает участие ряд белков и ферментов. Так, семейство ДНКтопоизомераз (I, II и III), обладая нуклеазной активностью, участвует в регуляции суперспирализации ДНК. Например, ДНК-топоизомераза I разрывает фосфоэфирную связь в одной из цепей двойной спирали и ковалентно присоединяется к 5'-концу в точке разрыва . По окончании формирования репликативной вилки фермент ликвидирует разрыв в цепи и отделяется от ДНК.

Разрыв водородных связей в двухцепочечной молекуле ДНК осуществляет ДНК-хеликаза.Фермент ДНК-хеликаза использует энергию АТФ для расплетения двойной спирали ДНК.

В результате происходит раскручивание участка суперспирализованной молекулы ДНК. В поддержании этого участка ДНК в раскрученном состоянии участвуют SSB-белки (от англ, single strand binding proteins, т.е. белки, связывающиеся с одноцепочечными нитями ДНК). SSB-белки, не закрывая азотистых оснований, связываются с одноцепочечной ДНК по всей длине разделившихся цепей и таким образом предотвращают их комплементарное скручивание и образование "шпилек". Они обладают большим сродством к одноцепочечным участкам ДНК, независимо от первичной структуры цепей.

30. Элонгация и терминация репликации. Ферменты. Асимметричный синтез ДНК. Фрагменты Оказаки. Роль ДНК-лигазы в формировании непрерывной и отстающей цепи.

Репликация ДНК осуществляется ДНК-зависимыми ДНК-полимеразами .Субстратами и источниками энергии для синтеза продукта служат 4 макроэргических соединения - дезоксирибонуклеозидтрифосфаты дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ, для активации которых необходимы ионы магния. Нейтрализуя отрицательный заряд нуклеотидов, они повышают их реакционную способность. Ферменты проявляют каталитическую активность только в присутствии предварительно раскрученной матричной двухцепочечной ДНК. Синтез цепей ДНК происходит в направлении 5'→3' растущей цепи, т.е. очередной нуклеотид присоединяется к свободному 3'-ОН-концу предшествующего нуклеотидного остатка. Синтезируемая цепь всегда антипараллельна матричной цепи. В ходе репликации образуются 2 дочерние цепи, представляющие собой копии матричных цепей.

В синтезе эукариотических ДНК принимают участие 5 ДНК-полимераз (α, β, γ, δ, ε). ДНКполимеразы различают по числу субъединиц, молекулярной массе, ассоциации с разными вспомогательными белками, ускоряющими процесс биосинтеза ДНК, и функциональному назначению.

ДНК-полимеразы α (альфа), β (бета), δ (дельта), ε (эпсилон) участвуют в синтезе ДНК в ядре клеток, ДНКполимераза γ (гамма) - в репликации митохондриальной ДНК.

ДНК-полимеразы β, δ, ε не могут инициировать образование дочерних цепей, так как не имеют сродства к одиночной нити ДНК. Инициирует репликацию ДНК-полимераза α, которая комплементарна определѐнному сайту одноцепочечной ДНК. Присоединяясь к нему, ДНК-полимераза а синтезирует небольшой фрагмент РНК - праймер, состоящий из 8-10 рибонуклеотидов. ДНК-полимераза а состоит из четырѐх субъединиц. Каждая из субъединиц фермента выполняет определѐнную функцию: "узнавание" сайта репликации, синтез праймера (8-10 рибонуклеотидов), синтез фрагмента цепи ДНК, около 50 дезоксирибонуклеотидов. Таким образом, ДНК-полимераза α синтезирует олигонуклеотид, содержащий примерно 60 нуклеотидных остатков; первые 8-10 представлены рибонуклеотидами (праймер), а остальные - дезоксирибонуклеотидами.

ДНК-полимераза δ

Олигонуклеотид, синтезированный ДНК-полимеразой α и образующий небольшой двухцепочечный фрагмент с матрицей, позволяет присоединиться ДНК-полимеразе δ и продолжить синтез новой цепи в направлении от 5'- к 3'-концу по ходу раскручивания репликативной вилки.

ДНК-полимераза δ последовательно наращивает цепь, шаг за шагом присоединяя к ней соответствующие дезоксинуклеотиды. Выбор ДНК-полимеразой δ очередного нуклеотида определяется матрицей. Включение дезоксирибонуклеозидмонофосфатов в растущую цепь ДНК сопровождается гидролизом макроэргических связей соответствующих нуклеозидтрифосфатов и отщеплением пирофосфата (Н4Р2О7). Энергия макроэргических связей расходуется на образование 3',5'-фосфодиэфирной связи между последним нуклеотидом растущей цепи ДНК и присоединяемым нуклеотидом. Включение нуклеотида в синтезируемую цепь ДНК невозможно без предварительного связывания азотистого основания водородными связями с комплементарным нуклеотидом матричной цепи. ДНК-полимеразы (α, β, γ, δ, ε) могут синтезировать нуклеотидную цепь только в направлении 5'→3', матричная цепь всегда считывается в направлении 3'→5'.

В каждой репликативной вилке идѐт одновременно синтез двух новых (дочерних) цепей. Направление синтеза цепи ДНК совпадает с направлением движения репликативной вилки лишь для одной из вновь синтезируемых цепей (лидирующая цепь). На второй матричной цепи синтез дочерней ДНК осуществляется двумя ферментами: ДНК-полимеразой α и ДНК-полимеразой ε в направлении 5'→3', но против движения репликативной вилки. Поэтому вторая цепь синтезируется прерывисто, короткими фрагментами, которые называют "фрагменты Оказаки" (по имени открывшего их исследователя). Дочерняя цепь ДНК, синтез которой происходит фрагментами, называют отстающей цепью. Каждый фрагмент Оказаки, примерно 100 нуклеотидных остатков, содержит праймер. Праймеры удаляет ДНКполимераза β, постепенно отщепляя с 3'-конца фрагмента по одному рибонуклеотиду. К ОН-группе на 3'- конце предыдущего фрагмента ДНК-полимераза β присоединяет дезоксирибонуклеотиды в количестве, равном вырезанному праймеру и таким образом заполняет брешь, возникающую при удалении рибонуклеотидов.

Фермент ДНК-лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между 3'-ОН-группой дезоксирибозы одного фрагмента цепи ДНК и 5'-фосфатом следующего фрагмента. Реакция протекает с затратой энергии АТФ. Таким образом, из множества фрагментов Оказаки образуется непрерывная цепь ДНК.

31. Повреждения и репарация ДНК. Виды повреждений. Способы репарации. Дефекты репарационных систем и наследственные болезни.

Процесс, позволяющий живым организмам восстанавливать повреждения, возникающие в ДНК, называют репарацией. Все репарационные механизмы основаны на том, что ДНК - двухцепочечная молекула, т.е. в клетке есть 2 копии генетической информации. Если нуклеотидная последовательность одной из двух цепей оказывается повреждѐнной (изменѐнной), информацию можно восстановить, так как вторая (комплементарная) цепь сохранена.

Процесс репарации происходит в несколько этапов. На первом этапе выявляется нарушение комплементарности цепей ДНК. В ходе второго этапа некомплементарный нуклеотид или только основание устраняется, на третьем и четвѐртом этапах идѐт восстановление целостности цепи по принципу

комплементарности. Однако в зависимости от типа повреждения количество этапов и ферментов, участвующих в его устранении, может быть разным.

Очень редко происходят повреждения, затрагивающие обе цепи ДНК, т.е. нарушения структуры нуклеотидов комплементарной пары. Такие повреждения в половых клетках не репарируются, так как для осуществления сложной репарации с участием гомологичной рекомбинации требуется наличие диплоидного набора хромосом.

А. Спонтанные повреждения

Нарушения комплементарности цепей ДНК могут происходить спонтанно, т.е. без участия каких-либо повреждающих факторов, например в результате ошибок репликации, дезаминирования нуклеотидов, депуринизации.

Ошибки репликации

Точность репликации ДНК очень велика, но примерно один раз на 105-106 нуклеотидных остатков происходят ошибки спаривания, и тогда вместо пары нуклеотидов А-Т, G-С в дочернюю цепь ДНК оказываются включѐнными нуклеотиды, некомплементарные нуклеотидам матричной цепи. Однако ДНКполимеразы δ, ε способны после присоединения очередного нуклеотида в растущую цепь ДНК делать шаг назад (в направлении от 3'- к 5'- концу) и вырезать последний нуклеотид, если он некомплементарен нуклеотиду в матричной цепи ДНК. Этот процесс исправления ошибок спаривания (или коррекция) иногда не срабатывает, и тогда в ДНК по окончании репликации остаются некомплементарные пары, тем более, что ДНК-полимераза а лишена корректирующего механизма и "ошибается" чаще, чем другие полимеразы.

При неправильном спаривании в первичной структуре дочерней цепи ДНК необычные основания не появляются, нарушена только комплементарность. Система репарации некомплементарных пар должна происходить только на дочерней цепи и производить замену некомплементарных оснований только в ней. Ферменты, участвующие в удалении неправильной пары нуклеотидов, распознают матричную цепь по наличию метилированных остатков аденина в последовательностях -GATC-. Пока основания нуклеотидных остатков в дочерней цепи неметилированы, ферменты должны успеть выявить ошибку репликации и устранить еѐ.

Распознавание и удаление (первый этап) некомплементарного нуклеотида происходят при участии специальных белков mut S, mut L, mut H. Каждый из белков выполняет свою специфическую функцию. Mut S находит неправильную пару и связывается с этим фрагментом. Mut Н присоединяется к метилированному (по аденину) участку -GATC-, расположенному вблизи некомплементарной пары. Связующим между mut S и mut Н служит белок mut L, его присоединение завершает образование активного фермента. Формирование комплекса mut S, mut L, mut Н на участке, содержащем ошибку, способствует проявлению у белка mut Н эндонуклеазной активности. Ферментативный комплекс гидролизует фосфоэфирную связь в неметилированной цепи .

К свободным концам цепи присоединяется экзонуклеаза (второй этап). Отщепляя по одному нуклеотиду в направлении от 3'- к 5'- концу дочерней цепи, она устраняет участок, содержащий некомплементарную пару. Брешь застраивает ДНК-полимераза β (третий этап), соединение основного и вновь синтезированного участков цепи катализирует фермент ДНК-лигаза (четвѐртый этап). Для успешного функционирования экзонуклеазы, ДНК-полимеразы р и ДНК-лигазы необходимо участие в репарации хеликазы и SSB-белков.

Депуринизация (апуринизация)

ДНК каждой клетки человека теряет за сутки около 5000 пуриновых остатков вследствие разрыва N- гликозидной связи между пурином и дезоксирибозой .

Тогда в молекуле ДНК на месте этих оснований образуется участок, лишѐнный азотистых оснований, названный АП-сайтом (AP-site, или апуриновый сайт). Термин "АП-сайт" используют также в тех случаях, когда из ДНК выпадают пиримидиновые основания и образуются апиримидиновые сайты (от англ, apurinicapyrimidinic site).

Этот тип повреждений устраняет фермент ДНК-инсертаза (от англ, insert - вставлять), который может присоединять к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности. В этом случае нет необходимости разрезать цепь ДНК, вырезать неправильный нуклеотид и репарировать разрыв.

Дезаминирование

Реакции дезаминирования цитозина и превращение его в урацил , аденина в гипоксантин, гуанина в ксантин происходят значительно реже, чем депуринизация, и составляют 10 реакций на один геном в сутки.

Исправление этого вида спонтанного повреждения происходит в 5 этапов (рис. 4-24). В репарации принимает участие ДНК-N-гликозилаза, гидролизующая связи между аномальным основанием и дезоксирибозой (первый этап), в результате образуется АП-сайт, который распознаѐт фермент АПэндонуклеаза (второй этап). Как только в цепи ДНК возникает разрыв, в работу вступает ещѐ один фермент - АП-экзонуклеаза, который отщепляет от цепи дезоксирибозу, лишѐнную основания (третий этап). В цепи ДНК появляется брешь размером в один нуклеотид. Следующий фермент ДНК-полимераза b к З'-концу разорванной цепи присоединяет нуклеотид по принципу комплементарности (четвѐртый этап). Чтобы соединить два свободных конца (3'-конец встроенного нуклеотида и 5'-конец основной цепи), требуется ещѐ один фермент - ДНК-лигаза (пятый этап).

Нерепарируемо и поэтому опасно дезаминирование метилированного цитозина. Продукт его спонтанного дезаминирования - тимин,

Б. Индуцируемые повреждения

Индуцируемые повреждения возникают в ДНК в результате воздействия разнообразных мутагенных факторов как радиационной, так и химической природы.

Образование димеров пиримидиновых оснований

Под действием УФО двойная связь между С5 и С6 атомами углерода в составе пиримидиновых оснований (тимине и цитозине) может разрываться. Атомы углерода остаются связанными одной связью. Расстояние между параллельными плоскостями оснований полинуклеотидной цепи, в которых произошѐл

разрыв., равно примерно 3,4 . Это расстояние позволяет освободившимся валентностям между С-С атомами пиримидиновых оснований, расположенных последовательно в цепи ДНК, сформировать циклобутановое кольцо . В зависимости от того, какие основания соединены в димер, их называют димерами тимина, цитозина или тимин-цитозиновыми димерами.

Удаление пиримидиновых димеров происходит под действием фотолиазы Фермент расщепляет вновь образовавшиеся связи между соседними пиримидиновыми основаниями и восстанавливает нативную структуру. В фотолиазе есть участок, либо сам поглощающий фотоны (в синей части спектра), либо связывающийся с кофакторами, адсорбирующими свет. Таким образом, свет активирует фотолиазу, которая распознаѐт димеры в облучѐнной ДНК, присоединяется к ним и разрывает возникшие между пиримидиновыми кольцами связи. После этого фермент отделяется от ДНК.

Повреждения оснований ДНК химическими мутагенами

Азотистые основания в ДНК могут подвергаться разнообразным повреждениям: алкилированию, окислению, восстановлению или связыванию основания с формамидными группировками. Репарация начинается с присоединения ДНК-N-гликозилазы к повреждѐнному основанию. Существует множество ДНК-М-гликозилаз, специфичных к разным модифицированным основаниям. Ферменты гидролитически расщепляют N-гликозидную связь между изменѐнным основанием и дезоксирибозой, это приводит к образованию АП-сайта в цепи ДНК (первый этап). Репарация АП-сайта может происходить или только при участии ДНК-инсертазы, которая присоединяет к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности, или при участии всего комплекса ферментов, участвующих в репарации: АПэндонуклеазы, АП-экзонуклеазы, ДНК-полимеразы β и ДНК-лигазы.

В. Дефекты репарационных систем и наследственные болезни